JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:02 min • July 8th, 2025
Para transducir células huésped con ARN que contenga vectores retrovirales, tome un tubo que contenga vectores empaquetados en medios adecuados. Cada vector contiene una cápside viral, que contiene el complemento de ARN del transgén que se integrará en el genoma del huésped e importantes enzimas virales. Una bicapa lipídica rodea la cápside para facilitar la entrada en la célula huésped.
Agregue los vectores en presencia de un reactivo de transfección adecuado al pocillo de una placa de cultivo que contenga la suspensión de la célula huésped. Cubre el plato. Centrífuga a baja velocidad para permitir la transducción de espín. Esto acerca el vector viral a la superficie de la célula huésped, aumentando la eficiencia de la transducción.
Simultáneamente, los policationes en el reactivo de transfección neutralizan las cargas negativas en el virus y la célula huésped, promoviendo la adsorción viral en las células diana.
En consecuencia, los receptores en la superficie del virus facilitan su fusión con la membrana del huésped. La cápside viral ingresa a la célula y se rompe, liberando ARN transgénico y enzimas virales en su citoplasma.
Dentro del citoplasma, la transcriptasa inversa viral convierte el ARN en un ADN complementario monocatenario, y luego lo convierte en ADN proviral bicatenario. El ADN resultante ingresa al núcleo. La enzima integrasa viral media la integración del ADN proviral en el genoma del huésped, lo que da como resultado células transducidas.
Recolecte sobrenadante viral fresco de la línea celular productora viral. En este punto, las células deben estar bien espaciadas con una morfología definida. A continuación, aspire con cuidado los 2 mililitros superiores de medio de cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene las células de la médula ósea. Evite aspirar las células de la médula ósea que generalmente se concentran en el medio del pozo.
Agregue 3 mililitros de sobrenadante viral recién suplementado a cada pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene células de médula ósea. Después de envolver las placas en plástico, repita la transducción de centrifugación y luego coloque las placas sin envolver en la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 24 horas del tercer día, retire y reemplace 2 mililitros de medio de los pocillos.