JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 2:44 min • July 8th, 2025
La esteatosis hepática es una condición patológica caracterizada por una acumulación excesiva de grasas en los hepatocitos, un tipo de célula hepática prominente. Las grasas se depositan en forma de gotas lipídicas de diferentes tamaños en el citoplasma de los hepatocitos.
Estructuralmente, una gota de lípidos contiene un núcleo de grasas neutras e hidrofóbicas, como triglicéridos y ésteres de colesterol. El núcleo está rodeado por una monocapa de fosfolípidos decorada con varias proteínas.
Para visualizar la deposición de grasa, tome una placa de pocillos múltiples que contenga un cultivo de hepatocitos adherido. Las células se tratan previamente con un medio esteatogénico para inducir la acumulación de gotas de lípidos en su interior.
Agregue la concentración deseada de paraformaldehído, que se difunde en las células y reticula las proteínas. Este paso desactiva las proteasas y preserva la estructura de los hepatocitos. Deseche el paraformaldehído y agregue la solución Oil-red-O que contiene el colorante orgánico disuelto en isopropanol.
El isopropanol actúa como disolvente portador de las moléculas de Oil-red-O escasamente solubles. Esto ayuda a que las moléculas de tinte entren en los hepatocitos fijos y finalmente lleguen a las gotas de lípidos. Una vez dentro, el colorante se transfiere del isopropanol a los lípidos neutros debido a su mayor afinidad, formando el complejo colorante-lípido. Esto da como resultado una coloración roja de las gotas de lípidos.
Deseche el exceso de tinte y observe las células bajo un microscopio. Las gotas de lípidos intracelulares aparecen intensamente rojas.
Coloque un cubreobjetos de cultivo celular en cada pocillo en una placa de 24 pocillos y siembre las células HepG2, como se describe en el manuscrito del texto. Después de la incubación adecuada, lave las células con 1 mililitro de PBS y deseche el sobrenadante. Fíjelos con 1 mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS e incube durante 1 hora a temperatura ambiente. Deseche el exceso de paraformaldehído y enjuague las células con 1 mililitro de agua destilada.
Luego, agregue 1 mililitro de isopropanol al 70% e incube durante 5 minutos. Deseche el exceso de isopropanol y agregue 1 mililitro de solución de Oil-red O e incube durante 30 minutos. Deseche el exceso de solución de Oil-red O y luego enjuague con 1 mililitro de agua destilada. Observe las células bajo el microscopio con un aumento de 400x.