Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:10 min. • July 8th, 2025
Las células del músculo liso vascular, o CMLV, son los componentes celulares prominentes en la túnica media, la capa media de la pared del vaso sanguíneo. En respuesta a señales patológicas o envejecimiento, estas células median la calcificación vascular, un fenómeno de acumulación de calcio en la matriz extracelular.
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga una capa adherente de cultivo de CMLV aórtica murina precalcificada. Incube las células con una solución de formalina para reticular las proteínas celulares y estabilice la estructura de las CMLV antes de la tinción.
Comience la tinción de von Kossa aspirando formalina del pocillo y agregando una solución de nitrato de plata. Incube la placa bajo una fuente de luz adecuada.
Una vez que la solución de nitrato de plata llega a los sitios de calcificación en la matriz extracelular de la capa VSMC, los iones de plata reemplazan a los iones de calcio unidos al fosfato. Esto da como resultado una coloración amarilla transitoria. En presencia de materia orgánica y luz, la degradación fotoquímica del fosfato de plata da como resultado la formación de plata metálica de color negro.
Deseche la cantidad máxima de solución de nitrato de plata gastada. Trate las células con una solución de tiosulfato de sodio. Esta solución convierte las sales de plata residuales en un complejo soluble en agua, que se puede eliminar mediante un enjuague final con agua, mejorando el contraste de las manchas.
Tome imágenes de las células teñidas para localizar los depósitos negros insolubles que indican calcificación.
Para inducir la calcificación en las células del músculo liso vascular, transfiera las células a la placa de cultivo de seis pocillos y deje que se adhieran. A continuación, vuelva a alimentar las células en medios de calcificación. Incube las células a 37 grados centígrados durante al menos siete días. Luego, aspire el medio de la placa de cultivo celular. Lave las celdas una vez en agua desionizada.
Fije las células colocándolas en 1 mililitro de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, retire la formalina y lave las celdas fijas con agua destilada durante 5 minutos.
Luego, incube las células en 1 mililitro de solución de nitrato de plata al 5% bajo una bombilla de 60 a 100 vatios durante 1 a 2 horas. Luego, aspire la solución de nitrato de plata y lave con agua destilada durante 5 minutos. Después de 5 minutos, retire la plata sin reaccionar colocando las células en 1 mililitro de solución de tiosulfato de sodio al 5% en agua destilada durante 5 minutos. Posteriormente, enjuague las células con agua destilada durante 5 minutos. Las células teñidas con von Kossa ahora están listas para obtener imágenes con microscopía de luz invertida estándar.