JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 3:14 min • July 8th, 2025
Para la tinción específica del citoplasma celular en microambientes de tejidos blandos, obtenga un riñón de ratón recién recolectado. Trátelo con una solución fijadora que contenga formaldehído, ácido acético glacial y metanol. Incubar a bajas temperaturas.
El formaldehído penetra en las células, entrecruzando proteínas con proteínas y proteínas con ácidos nucleicos. El metanol desplaza el agua del tejido y coagula las proteínas. El ácido acético causa acidificación intracelular e hinchazón de los tejidos, contrarrestando así la contracción del tejido causada por el metanol.
La fijación inactiva las enzimas y estabiliza la morfología del tejido para su posterior tinción. Retire el exceso de fijadores con tampón. Incuba el tejido con eosina Y, un colorante ácido.
La eosina penetra en las células fijas y entra en el citoplasma. El ambiente ácido del citoplasma, del tratamiento con ácido acético, provoca la máxima protonación de grupos amino de proteínas citoplasmáticas.
La eosina, con grupos funcionales cargados negativamente, interactúa electrostáticamente con grupos protonados de proteínas, formando un complejo colorante-proteína estable, y tiñe el citoplasma de rosa al acumularse. Después de la incubación, corte el riñón teñido en trozos pequeños, seguido de deshidratación tisular en concentraciones crecientes de etanol.
Incruste el tejido renal en cera de parafina. Obtenga secciones de tejido delgado usando un micrótomo. Además, rehidrate las secciones para el análisis microscópico.
Los núcleos celulares no teñidos aparecen blancos contra un citoplasma teñido de rosa, lo que permite la visualización de microestructuras renales como túbulos contorneados proximales, que comprenden células epiteliales con bordes en cepillo, o conductos colectores, que están revestidos con células epiteliales aplanadas sin bordes en cepillo.
Comience fijando las muestras de tejidos blandos. Llene un tubo de centrífuga de 50 mililitros con una solución fijadora que contenga 9,5 mililitros de formaldehído al 4% y 0,5 mililitros de ácido acético glacial. Agregue la muestra de tejido blando al tubo de centrífuga y refrigérela durante 24 a 72 horas.
Después de la refrigeración, lave la muestra de tejido blando con una solución de DPBS durante 1 hora. Luego, tiñe la muestra colocándola en 2 mililitros de solución de tinción de eosina Y e incube en una placa vibratoria horizontal durante 24 horas.
Al día siguiente, saque con cuidado la muestra de tejido blando del recipiente de muestras y elimine el exceso de agente de tinción con papel de seda de celulosa. Colóquelo en un recipiente cónico sobre una fase de vapor de etanol para su almacenamiento y uso posterior.