Tinción de H&E de secciones de tejido incluidas en parafina: una técnica de tinción diferencial para visualizar secciones de tejido hepático utilizando una combinación de colorantes de hematoxilina y eosina

Comience la tinción con hematoxilina y eosina tomando un portaobjetos de vidrio que contenga la sección de tejido incluida en parafina. Sumerja el portaobjetos en una solución de desparafinación que contenga xileno, un disolvente orgánico que disuelve la capa de parafina alrededor del tejido, haciéndolo accesible a las manchas en los pasos posteriores.

Trate la sección de tejido con alcohol absoluto para eliminar el xileno. Sumerja el tejido en concentraciones decrecientes de alcohol. Este paso rehidrata el tejido reemplazando el alcohol con agua para una mejor compatibilidad con los tintes solubles en agua.

Tiña el tejido con hematoxilina básica, que en su forma oxidada se une al mordiente, un catión metálico. Este complejo se une electrostáticamente a los ácidos nucleicos del genoma, tiñendo el núcleo de púrpura.

Sumerja la sección teñida en una solución de diferenciación ácida para eliminar el exceso de hematoxilina del citoplasma, haciendo que el núcleo que retiene el colorante parezca distinto. Trate el tejido con un agente azulante alcalino para neutralizar los ácidos libres. Esto hace retroceder el color púrpura del tinte a azul, realzando los detalles nucleares.

Sumerja el portaobjetos en una solución de eosina ácida para teñir los componentes proteicos básicos en el citoplasma y las fibras del tejido conectivo en tonos de rojo a rosa. Tratar el tejido con alcohol para eliminar el exceso de eosina. Use concentraciones crecientes de etanol para deshidratar el tejido. Sumerja el portaobjetos en xileno para eliminar los reactivos restantes.

Tras las imágenes, las células de la sección de tejido muestran núcleos de color azul claro y regiones citoplasmáticas rosadas.

Desparafina los portaobjetos sumergiéndolos en xileno al 100%, dos veces, durante 15 minutos cada vez. Luego, rehidrate los portaobjetos a través de un gradiente de etanol. Para cada solución, sumerja de 8 a 10 veces, durante dos segundos por inmersión, hasta que el líquido salga limpiamente de los portaobjetos. Coloque los portaobjetos en hematoxilina Harris 100% filtrada durante cuatro minutos.

Después de cuatro minutos, transfiéralos rápidamente al recipiente con agua desionizada. Deje correr agua desionizada en la esquina posterior del recipiente más alejada de las secciones. Vacíe el recipiente periódicamente hasta que el agua ya no sea morada.

Verifique rápidamente la intensidad de la hematoxilina en un microscopio de disección con luces de cuello de cisne. Regrese los portaobjetos al 100% de hematoxilina durante un minuto, si se requiere una tinción adicional.

Una vez obtenida la tinción de hematoxilina deseada, sumerja los portaobjetos dos veces en ácido clorhídrico al 0,05% y, a continuación, transfiéralos inmediatamente al recipiente con agua limpia desionizada. Vacíe y vuelva a llenar el recipiente con agua dos veces.

Transfiera los portaobjetos a dos recipientes de etanol al 95% durante 30 segundos cada uno. Coloque los portaobjetos en la solución de eosina Y floxina-B durante dos minutos.

Después de los dos minutos, transfiera los portaobjetos nuevamente al recipiente de etanol al 95% anterior, luego verifique la intensidad del color bajo el microscopio de disección. Si la tinción no es suficiente, regrese a la solución de eosina durante 30 segundos. Repita según sea necesario.

Cuando se haya obtenido una tinción de la intensidad deseada, transfiera los portaobjetos al 100% de isopropanol durante 15 segundos. Reemplácelo con isopropanol 100% nuevo y vuelva a colocar los portaobjetos en el isopropanol durante otros 15 segundos. Repita este proceso para un total de seis lavados de isopropanol.

Después de sumergir en xileno al 100% durante tres minutos, retire un portaobjetos, agregue suficiente medio de montaje para cubrir las secciones y luego, sumerja el portaobjetos en xileno al 100%.

Aplique un cubreobjetos al portaobjetos y seque el exceso de medio de montaje en una toalla de papel hasta que solo se vea una línea delgada. Luego, sumerja un pañuelo en el xileno y limpie la parte posterior del portaobjetos para eliminar cualquier medio que haya goteado.

Coloque el portaobjetos plano sobre una superficie resistente pero móvil, como un trozo de cartón, y deje que el xileno se evapore en la campana durante 10 minutos. Deje los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el medio de montaje se endurezca antes de la obtención de imágenes.