Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 4:33 min. • July 8th, 2025
Durante la metástasis del cáncer, las células tumorales de un tumor primario viajan a través del sistema circulatorio, se extravasan a órganos distantes y establecen tumores secundarios.
Para evaluar la metástasis pulmonar en un modelo de ratón de cáncer de mama al que se le han inyectado células 4T1, células de cáncer de mama altamente metastásicas, prepare una suspensión celular, incluidas las células 4T1, aisladas de los pulmones recolectados. Centrifugar la suspensión y volver a suspender las células en medios que contengan 6-tioguanina, 6-TG, un análogo de la guanina. Siembre la suspensión celular en una placa de cultivo.
6TG ingresa a las células normales donde la enzima transferasa específica lo convierte en nucleótido 6-TG, un nucleótido tóxico. Estos nucleótidos citotóxicos se incorporan al ADN, causando daño al ADN, y eliminan selectivamente las células del cultivo. Las células 4T1 tienen una capacidad disminuida para formar nucleótidos tóxicos, lo que facilita su supervivencia y adherencia a la placa. Dependiendo de la capacidad proliferativa de las células, forman colonias.
Trate las células con metanol. El metanol permeabiliza las células y desnaturaliza las proteínas celulares. Incuba las células con azul de metileno.
El colorante cargado positivamente ingresa a la célula, interactúa con el ADN cargado negativamente, intercalándose en espacios entre los pares de bases adyacentes de las hebras de ADN. También se une al ARN en el citoplasma, pero con menor afinidad. Los núcleos se tiñen de azul oscuro debido a la alta concentración de ADN que el citoplasma debido a la baja concentración de ARN. Las colonias metastásicas aparecen como puntos azules.
Imagen de la placa. Utilizar software para determinar las colonias metastásicas, cuantificando la carga metastásica en los pulmones del ratón.
Lleve el volumen del tubo a 10 mililitros con 1X HBSS. Luego, vierta el contenido sobre un colador celular de 70 micrómetros en el tubo cónico de 50 mililitros. Use el émbolo de una jeringa de 1 mililitro para moler suavemente la muestra a través del filtro.
Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 350 veces g, y desechar el sobrenadante. Luego lave el gránulo dos veces con 10 mililitros de 1X HBSS. Vuelva a suspender el sedimento en 10 mililitros de 60 micromolares de medios de cultivo completos de 6-tioguanina y coloque las muestras en placas de cultivo celular de 10 centímetros utilizando un esquema de dilución, si lo desea.
Incube las placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 5 días. Vierta los medios de cultivo de las placas en el contenedor de residuos apropiado. Para fijar las células, agregue 5 mililitros de metanol sin diluir a cada placa e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de agitar el metanol para que cubra toda la placa.
Vierta el metanol de las placas en el contenedor de desechos apropiado, luego, enjuague cada placa con 5 mililitros de agua destilada. Agregue 5 mililitros de azul de metileno al 0,03% por placa e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente, asegurándose de agitar la solución de azul de metileno para que cubra toda la placa. Vierta el azul de metileno en el contenedor de desechos apropiado y enjuague cada plato nuevamente con 5 mililitros de agua destilada.
Dale la vuelta al plato y sécalo contra una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido. Coloque el plato en su tapa y déjelo secar al aire durante la noche. Las colonias metastásicas serán azules. Una vez que las placas se han secado, se pueden almacenar a temperatura ambiente indefinidamente.