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Para visualizar las regiones de cartílago y hueso en una sección de tejido, comience con un portaobjetos de vidrio que lleve una sección delgada de tejido de embrión de ratón congelado de interés.
Descongele brevemente la criosección y sumérjala en una concentración de etanol adecuada para eliminar el medio de crio-inclusión. El paso de eliminación ayuda a evitar el aflojamiento del medio, que de otro modo podría afectar la visualización del tejido durante la tinción. Además, el etanol fija el tejido, manteniendo la morfología e integridad del tejido.
A continuación, pipetee una solución de violeta de cresilo sobre el tejido. La violeta de cresil, un colorante básico cargado positivamente, se une a restos polianiónicos como los proteoglicanos en la matriz del tejido cartilaginoso. Mientras que, en tejidos mineralizados como los huesos, reacciona con grupos cargados negativamente, como los grupos fosfato en la matriz ósea.
Al ser un tinte metacromático, el violeta de cresilo tiñe diferentes regiones del tejido en colores diferentes del tinte natural en función de su interacción con diferentes componentes químicos dentro de esas regiones.
Ahora, lave el pañuelo en una concentración de etanol adecuada para eliminar el exceso de mancha. Sumerja el tejido en concentraciones crecientes de etanol para reemplazar el agua del tejido, deshidratando el tejido. Lave el tejido con xileno para desplazar el etanol, haciendo que el tejido sea transparente para la microscopía.
Bajo un microscopio óptico, el tejido cartilaginoso aparece magenta mientras que el tejido óseo aparece marrón, lo que facilita su diferenciación entre sí y del tejido circundante.
Prepare tres tubos de centrífuga de 50 mililitros etiquetados. Agregue 45 mililitros de etanol al 80% a cada tubo. Coloque tres tubos en hielo. Coloque un tubo que contenga 45 mililitros de etanol al 95% y un tubo que contenga etanol al 100% sobre hielo. A continuación, agregue 45 mililitros de xileno a un tubo de centrífuga de 50 mililitros a temperatura ambiente.
Descongele brevemente una diapositiva de membrana PEN colocándola contra una mano enguantada y lávela dos veces durante 30 segundos en cada uno de los tubos que contienen etanol al 80% con agitación, para eliminar el compuesto de temperatura de corte óptima. Luego, coloque el portaobjetos sobre una hoja de papel de aluminio. Pipetear 0,8 mililitros de violeta de cresilo al 0,1% en etanol al 50% sobre el portaobjetos y teñir durante 30 segundos.
Lave el portaobjetos en el tercer tubo que contiene etanol al 80% durante 30 segundos. Deshidrate el portaobjetos pasándolo a través del tubo que contiene etanol al 95% durante 30 segundos, el tubo que contiene etanol al 100% durante 30 segundos y, finalmente, el tubo que contiene xileno durante 30 segundos. Después de esto, coloque los portaobjetos en un limpiador de trabajo delicado durante 5 minutos para dejar que el xileno se escurra y permita que las secciones se sequen.