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Técnicas biológicas
0 vistas • 3:32 min • July 8th, 2025
En una población heterogénea de células tumorales, el tratamiento con un fármaco contra el cáncer mataría a la mayoría de las células, pero las células resistentes a los medicamentos sobreviven, lo que resulta en un fracaso terapéutico.
Para determinar la proporción de células resistentes a los medicamentos, siembre una población heterogénea de células tumorales en una placa de múltiples pocillos. Incubar para facilitar la adherencia celular. Agregue una concentración creciente de una solución farmacológica adecuada contra el cáncer.
La interacción con las moléculas del fármaco hace que las células sensibles mueran y, posteriormente, se desprendan de las placas de cultivo. Por el contrario, las células resistentes a los medicamentos sobreviven y permanecen adheridas a la placa.
Aspire el medio gastado para eliminar las células desprendidas. Agregue medios nuevos sin drogas e incube la placa en condiciones fisiológicas. Las células resistentes a los medicamentos proliferan y forman colonias tumorales. Ahora, agregue una solución de tinción violeta cristalina a las colonias e incube.
El violeta cristalino, una tinción de color púrpura, permeable a la membrana y cargada positivamente, ingresa a las células y se une a las proteínas aniónicas y al ADN, impartiendo así un color púrpura a las células.
A continuación, agregue etanol para solubilizar la mancha sin reaccionar. Lavar para eliminar cualquier exceso de mancha y secar al aire la placa.
Las colonias resistentes a los medicamentos aparecen como puntos morados. Cuente el número de colonias de colores en cada pozo. Represente el porcentaje de viabilidad celular en un gráfico para determinar la proporción de células cancerosas resistentes a los medicamentos en cada concentración de fármaco.
En este procedimiento, coloque placas de 2000 células, utilizando 2 mililitros de medios por pocillo, en las placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, agregue concentraciones crecientes de Docetaxel para las líneas celulares DU145 y 22Rv1. Agregue DMSO solo a un pocillo como control al mismo volumen utilizado para la dosis más alta de docetaxel.
Después de 72 horas, aspire el medio que contiene el fármaco y agregue un medio nuevo sin docetaxel. Incube las placas durante una o dos semanas, hasta que las colonias sean visibles bajo el microscopio.
Para teñir las colonias, lávelas suavemente con 2 a 3 mililitros de PBS e incube con dos a tres mililitros de solución violeta cristalina durante 20 minutos, dentro de la campana de cultivo de tejidos o una campana extractora. Luego, retire la solución de tinción y lave las placas con 2 a 3 mililitros de agua. Luego, retire el agua y seque al aire los platos.
Tome imágenes digitales de las placas para la representación de figuras. Analice el resultado visualizando los pozos y contando manualmente las colonias con la ayuda de un rotulador.