Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 3:08 min. • July 8th, 2025
Los osteoclastos son células grandes, en forma de cúpula y multinucleadas que se encuentran en la superficie ósea. Estas células contienen numerosos gránulos citoplasmáticos ricos en fosfatasa ácida resistente al tartrato, o TRAP, una enzima metaloproteica secretada desde el borde ondulado de los osteoclastos hacia el tejido óseo. Esta enzima digiere la matriz extracelular y disuelve los cristales minerales, facilitando la reabsorción ósea.
Para detectar los gránulos de TRAP como marcadores citoquímicos de osteoclastos, tome una placa de cultivo que contenga osteoclastos adherentes. Agregue la solución de tinción TRAP a las células. Esta solución comprende el sustrato: un derivado de naftol que contiene fosfato y ácido tartárico en un tampón complementado con una sal de diazonio.
Agregue ácido acético a esta solución para mantener el pH ácido necesario para la tinción TRAP. Incube las células en la oscuridad a temperatura fisiológica para una actividad óptima de la enzima TRAP.
La solución de tinción ingresa a los osteoclastos, donde el ácido tartárico inhibe la actividad hidrolizante de las fosfatasas ácidas sensibles al tartrato en otras células.
Al mismo tiempo, TRAP hidroliza el sustrato agregado para eliminar su grupo fosfato. El sustrato hidrolizado se acopla con una sal de diazonio de la solución de tinción para formar un complejo de colorante insoluble de color granate. Este complejo precipita en forma de gránulos en los sitios de actividad enzimática.
Obtener imágenes de las células bajo un microscopio. La deposición de gránulos de colorante granate dentro del citoplasma confirma la presencia de osteoclastos que contienen TRAP en el cultivo.
En este paso, aspire el medio y lave la muestra suavemente tres veces con 1X PBS. A continuación, fije las células en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con 100 microlitros de solución fija durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Después de la fijación, aspire la solución fija y lave las células suavemente tres veces con agua desionizada, precalentada a 37 grados centígrados. Luego, aspire el agua desionizada y agregue 100 microlitros de tinción TRAP en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos y protéjala de la luz. Después de teñir, aspire la mancha TRAP y lave suavemente tres veces con agua desionizada. Posteriormente, obtenga imágenes de los osteoclastos en un microscopio invertido con un aumento de 40X.