Tinción de plata de glicosaminoglicanos sulfatados: un método de tinción para la visualización de glicosaminoglicanos sulfatados en geles de poliacrilamida

Los glicosaminoglicanos sulfatados, GAG, son polisacáridos lineales largos, cargados negativamente, con cadenas unitarias de disacáridos repetitivos sulfatadas en distintas posiciones, que existen en longitudes variables.

Para visualizar GAG sulfatados aislados de interés que difieren en la longitud de la cadena en un gel de poliacrilamida después de la electroforesis, retire con cuidado el gel de su casete. Enjuague con agua desionizada, eliminando las piezas de gel adheridas que puedan interferir con las manchas.

Tratar con una solución ácida de azul alcián. En condiciones ácidas, el azul alcián, un colorante catiónico polivalente con un átomo de cobre en el centro, interactúa específicamente con los GAG sulfatados cargados negativamente a través de interacciones iónicas, formando un complejo azul profundo insoluble en agua.

Lave el gel con agua desionizada y metanol, eliminando cualquier mancha residual. Incube el gel con una solución alcalina de nitrato de plata. En condiciones alcalinas, los GAG sulfatados unidos al azul alcián proporcionan sitios para que los iones de plata cargados positivamente se unan y formen complejos.

Trate el gel en una solución reveladora que contenga formaldehído y ácido cítrico. El ácido cítrico reduce el pH local para una actividad óptima del formaldehído, lo que reduce los iones de plata a plata metálica insoluble dentro de los fragmentos de GAG sulfatados, amplificando la señal azul alcián.

Agregue una solución de parada para reducir el pH, evitando la reducción de iones de plata para una tinción de fondo mínima. Ahora, imagina el gel.

Las bandas de fragmentos de GAG sulfatadas teñidas de azul plateado alcian aparecen de color marrón oscuro o negro, lo que permite la visualización y determinación de alta sensibilidad de las longitudes de las cadenas de polímeros GAG aisladas.

Una vez que se complete la ejecución, desmonte el casete y extraiga con cuidado el gel en un recipiente grande y limpio lleno de agua filtrada desionizada. Luego, deseche el agua y tiñe el gel con solución de tinción azul alcián durante cinco minutos. Deseche la mancha de azul alcián y lave rápidamente dos o tres veces con agua filtrada desionizada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alcián.

Tiñe el gel en una solución para teñir con nitrato de plata en un recipiente nuevo y limpio durante 30 minutos. Luego lave dos o tres veces durante 30 minutos cada una en agua filtrada desionizada, para eliminar completamente la solución de manchas de plata. Deseche el agua y agregue la solución de revelado.

Observe cuidadosamente el gel para detectar la aparición de bandas. Dependiendo de la calidad de la tinción y de la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos. Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución de revelado y lave el gel brevemente con la solución de parada.