Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:52 min. • July 8th, 2025
Los ensayos de formación de colonias miden la capacidad proliferativa de las células para convertirse en colonias.
Primero, semilla de suspensión celular derivada de médula ósea que comprende eritrocitos y células mononucleares, incluidas las células madre mesenquimales o MSC, en medios en una placa de cultivo e incuba. Las MSC se adhieren al fondo de la placa, mientras que los eritrocitos y las células mononucleares permanecen en suspensión y se descartan.
Agregue medios nuevos que contengan factores de crecimiento para apoyar la supervivencia de MSC. Dependiendo de su potencial proliferativo individual, las MSC se replican para formar colonias.
A continuación, trate las colonias con metanol. El metanol permeabiliza las células, desplaza el agua del entorno intracelular y desnaturaliza las proteínas, preservando la arquitectura celular.
Incube las colonias fijas con la solución de tinción Giemsa, una mezcla de productos de oxidación de azul de metileno, principalmente azul B, un colorante básico, y eosina Y, un colorante ácido. Tras la difusión en las células, los dímeros B azules cargados positivamente se unen mediante intercalación al ADN cargado negativamente en el núcleo, impartiendo una tinción azul.
Los monómeros de eosina Y cargados negativamente interactúan con cargas positivas no neutralizadas en dímeros B azules unidos, formando un 'complejo eosina-Y-azul-B', cambiando la coloración del ADN teñido de azul a púrpura.
En el citoplasma rico en ribosomas, el azul B se une al ARN cargado negativamente, pero la penetración reducida de la eosina Y en los ribosomas altamente densos, previene la formación del complejo eosina-Y-azul-B, tiñendo el ARN de azul.
Ahora, lave la placa con tampón para eliminar el exceso de manchas y séquela al aire. Cuenta el número de colonias, que aparecen como grupos de células con núcleos morados y citoplasma azul.
Para realizar el ensayo de UFC, prepare 10 mililitros de solución de Giemsa por plato, utilizando agua estéril para diluir la solución madre 1 a 10. Retire el medio de la placa de cultivo celular y use PBS para lavar cuidadosamente las células.
Con metanol puro, fije las celdas a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego, deseche el metanol y agregue la solución de Giemsa. Incubar en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Después de la incubación, use PBS para lavar las células dos veces. Luego, seque al aire el plato con la cabeza sobre una toalla de papel. Con un marcador en la parte posterior de la placa, cuente manualmente las colonias.