Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Técnicas biológicas
0 visualizaciones • 2:42 min. • July 8th, 2025
Los proteoglicanos están compuestos por una proteína central unida covalentemente a cadenas de glicosaminoglicanos sulfatados.
Para visualizar los proteoglicanos, comience con andamios a base de colágeno, el sustrato polimérico poroso, y siembre la suspensión de células madre mesenquimales, o MSC, en ellos. Esto proporciona soporte estructural a las MSC y les permite crecer tanto en la superficie como dentro de las cavidades de los andamios.
Tratar las construcciones en un medio de diferenciación condrogénico que contiene factores de crecimiento transformadores que impulsan la transformación de las MSC en condrocitos maduros: células cartilaginosas. Los condrocitos maduros secretan proteoglicanos que forman una red con el colágeno en el andamio.
Tome una sección preparada a partir de la construcción cargada de condrocitos. Agregue una solución ácida de tinción de azul alcián suplementada con clorhidrato de guanidio e incube. Durante la incubación, el clorhidrato de guanidina en la solución de colorante disocia cualquier agregado de proteoglicanos para una mejor tinción.
Posteriormente, los glicosaminoglicanos sulfatados cargados negativamente de los proteoglicanos se unen a las moléculas de colorante azul alcián cargadas positivamente que contienen cobre, lo que da como resultado depósitos azules.
A continuación, sumerja el portaobjetos en una solución decolorante que contenga cloruro de magnesio. Los iones de magnesio compiten con las moléculas de colorante cargadas positivamente por los sitios de unión en los glicosaminoglicanos, evitando así la sobretinción.
Imagen de la sección. La coloración azul confirma la presencia de proteoglicanos en la muestra
Para llevar a cabo la diferenciación condrogénica de un dispositivo médico en forma de esponja constituido a partir de colágeno liofilizado tipo 1, corte cubos de 3 milímetros por lado. Sembrar MSC encima de los cubos a una concentración de 4 x 106 células/ml.
Después de permitir que las células se adhieran a los cubos durante 30 minutos a temperatura ambiente, mantenga las construcciones de colágeno MSC en medio condrogénico, como se indica en el protocolo de texto. Agregue una solución de azul alcián al 0,4% a las secciones e incube durante la noche a 4 grados centígrados.
Al día siguiente, use DMSO al 40% y cloruro de magnesio molar al 0,05 para lavar las células durante 30 minutos antes de usar rojo rápido nuclear para contrateñir las células.