Tinción de Sudán IV: Un procedimiento para teñir placas ateroscleróticas cargadas de lípidos en el arco aórtico de ratón extraído

aterosclerosis ocurre debido a la acumulación de lipoproteínas en el revestimiento interno de las arterias, lo que resulta en la acumulación de placa, engrosamiento y estrechamiento de las arterias y reducción del flujo sanguíneo.

Las placas consisten en una capa fibrosa con células de músculo liso y matriz extracelular, que encierra un núcleo compuesto de lipoproteínas de baja densidad, LDL - partículas esféricas con un núcleo hidrofóbico de ésteres de colesterol y triglicéridos, rodeadas por una capa externa de fosfolípidos - junto con células inflamatorias.

Para visualizar placas ateroscleróticas ricas en lípidos, obtenga un arco aórtico de ratón recién cosechado. Transfiéralo a una plataforma personalizada con fondo oscuro para mejorar el contraste durante las imágenes de área amplia. Agregue tampón para evitar la deshidratación de los tejidos.

Eliminar el tejido adiposo perivascular que rodea el arco aórtico para evitar la falsa tinción de fondo. Haga una incisión en la aorta y sus ramas longitudinalmente a través de la luz para exponer la superficie más interna con acumulación de placa aterosclerótica.

Asegure el arco aórtico abierto en la plataforma e incube en etanol. El etanol desplaza el agua del tejido, inactivando las proteínas y preservando la arquitectura del tejido.

Tratar con tinción Sudan IV solubilizada en disolventes orgánicos. Dentro de la placa, Sudan IV, un colorante diazo soluble en grasa que tiene una alta afinidad por los triglicéridos y los ésteres de colesterol de las lipoproteínas, pasa de la fase de disolvente orgánico y se une al núcleo hidrofóbico de lípidos de las LDL, formando complejos estables. Lave el exceso de manchas con etanol.

Bajo un microscopio estereoscópico, las placas ateroscleróticas ricas en lípidos teñidas aparecen de color rojo anaranjado, mientras que las áreas sin placa aparecen pálidas.

Para preparar un lecho de fijación para el análisis de la cara, doble un segmento de película de cera de parafina 8 veces para hacer una superficie plana de 25 x 25 milímetros y envuelva cinta aislante eléctrica negra alrededor de la película para hacer un fondo oscuro para la aorta.

Coloque una etiqueta en la parte posterior de la cama de fijación y use un lápiz de mina para anotar el número de identificación del mouse. Transfiera el arco aórtico al lecho de fijación y agregue una gota de PBS al tejido. Con un microscopio estereoscópico, limpie la aorta del tejido adiposo periadventicio restante y use tijeras Vannas y fórceps Dumont para pelar suavemente todo el tejido adiposo circundante sin manipular ni dañar la aorta.

A continuación, introduzca las tijeras Vannas en la luz aórtica para exponer la superficie de la íntima. Comience a cortar la curvatura externa del arco ascendente en la dirección distal y continúe cortando las ramas, incluida la arteria braquiocefálica, y sin afectar la parte dorsal de la región torácica descendente.

Para mostrar la superficie de la íntima, corte la curvatura menor y doble la aorta. Con un portaagujas micro Castroviejo, asegure el arco abierto al lecho de fijación con el extremo romo de los alfileres de insectos minuciosos sin estirar la muestra, doblando suavemente los pasadores lejos de la muestra, mientras el tejido se mantiene en su lugar. Luego, guarde el arco con alfileres boca abajo en una placa de Petri de PBS a 4 grados centígrados.

Para la tinción de Sudán IV, enjuague la muestra durante 5 minutos en una placa de Petri de etanol al 70% con el arco hacia abajo, antes de transferir la muestra a una placa de solución de trabajo Sudan IV durante 7 minutos.

Al final de la incubación, enjuague la muestra con dos lavados de 3 minutos en etanol al 80% para desteñir la superficie de la íntima normal seguido de un enjuague final en PBS, antes de devolver el tejido a su placa de Petri original. Luego, adquiera micrografías bajo un microscopio estereoscópico conectado a una cámara digital con un aumento de 10X, obteniendo imágenes del arco clavado sumergido en PBS, utilizando pequeños pesos metálicos para sujetar el lecho de fijación al fondo de la placa de Petri.