Name: Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda a aislar y caracterizar exosomas que contienen ARN mediante ultracentrifugación, microscopía electrónica y citometría de flujo. Estas técnicas permiten analizar el contenido molecular de vesículas extracelulares en estudios funcionales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (K2008-57X-20 676-01-3).

1. Aislamiento exosoma <ol><li> Se cultivan las células en un medio con exosoma libre de suero. Por lo tanto, cualquier suero añadido al medio de cultivo celular deberá ser agotado de exosomas por ultracentrifugación a 120 000 xg durante la noche a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Transferencia de la suspensión celular a tubos cónicos. </li><li> Centrifugar a 300 g durante 10 minutos a 4 ° C para que sedimenten las células. </li><li> Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga y si no está completamente lleno PBS agrega. </li><li> Centrifugar la muestra a 16 500 g durante 20 minutos a 4 ° C para eliminar más células y restos celulares. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras para eliminar las partículas mayores de 200 nm. </li><li> Transferir el sobrenadante se filtra a los tubos de ultracentrífuga nuevo y sellado de los tubos antes de ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para que sedimenten las exosomas. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para la recuperación de exosoma máximo, volver a suspender el enriquecimiento exosomaed pellet en varias ocasiones en un volumen pequeño (3 x 50 l) de una solución amortiguadora. Este buffer depende de los experimentos posteriores previstas tras el aislamiento exosoma. Por ejemplo, un tampón de lisis se utiliza para la proteína y el aislamiento de ARN, PBS se utiliza para la microscopía electrónica y citometría de flujo y por medio de los estudios funcionales pueden ser preferibles. </li></ol> Nota: exosomas también se puede aislar de diferentes fluidos corporales, tales como el plasma, utilizando el mismo procedimiento que para los medios de cultivo celular. Para fluidos viscosos, puede ser necesario diluir la muestra con PBS antes de la centrifugación y filtración. En relación con la velocidad de centrifugación para el punto 5, se puede aumentar a 29 500 xg, y la ultracentrifugación en el punto 7 se puede ampliar a 90 minutos 18. Si la muestra tiene que ser purificado el exosoma pellet se puede flotar en un gradiente de sacarosa y de los exosomas principalmente se encuentra en la fracción representing una densidad de 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Identificación exosoma por microscopía electrónica <ol><li> A fin de eliminar las proteínas contaminantes, resuspender el pellet exosoma enriquecido en PBS y ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para volver a precipitar las exosomas. </li><li> Tome una pequeña alícuota de la muestra para el aislamiento de la proteína y la medición de proteínas totales. Asegúrese de que sólo una pequeña parte de la muestra se lisaron y se utiliza para la medición de la proteína y mantener intacta la exosomas, resuelto en PBS, por separado o en el hielo a -80 ° C para experimentos adicionales. </li><li> Ponga una gota, aproximadamente 10 g de proteína exosomal de los exosomas intacta resuspendido en PBS, en una Parafilm. Luego, con pinzas, suavemente la posición de una rejilla de carbono recubiertos de níquel formvar en la parte superior de cada gota durante 30-60 minutos. Asegurar que la red se coloca con el lado frente a la caída de recubrimiento que contiene exosomas. </li><li> Coloque tres gotas, cada 30 l de PBS en tque Parafilm y lavar la red de forma secuencial el posicionamiento de la rejilla en la parte superior de las gotas de PBS, y el uso de un papel absorbente en el medio. Utilice el papel absorbente con cuidado sólo por la celebración de cerca a un lado de la red, sin hacer contacto con la superficie recubierta. </li><li> Fijar la muestra a través de depósito una caída de 2% de paraformaldehído en el Parafilm y el lugar de la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso de lavado en el punto 4, antes de la inmunotinción con un anticuerpo apropiado. Anticuerpos utilizados son anti-CD63 y anti-MHC de clase II. La microscopía electrónica también se puede realizar sin inmunotinción como exosomas se pueden identificar exclusivamente en función del tamaño y morfología. Sin embargo, se recomienda para evaluar el tamaño, la morfología y la presencia de una proteína de membrana para una validación más concluyentes. </li><li> Transferencia de la red a una caída de 30 l del anticuerpo primario de elección y se incuba durante 40 minutos. Lavar a repetir el punto 4, pero el uso de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS en lugar de PBS. </li><li> Repita el punto 7, pero con los 10 nm de oro y anticuerpo secundario marcado y lavar con PBS solo. </li><li> Después de fijar la muestra mediante la adición de una caída de 2,5% de glutaraldehído al Parafilm e incube la rejilla en la parte superior de la gota durante 10 minutos. Repita el lavado en el punto 4, pero el uso de cinco gotas de agua desionizada en lugar de tres gotas de PBS. </li><li> Contraste de la muestra mediante la adición de una gota de acetato de uranilo al 2% a la Parafilm e incube la red en la parte superior de la caída durante 15 minutos. </li><li> Integrar la muestra mediante la adición de una gota de metilcelulosa al 0,13% y el 0,4% de acetato de uranilo al Parafilm e incube la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Retire el exceso de líquido con cuidado utilizando un papel absorbente, antes de colocar la rejilla en un papel con la cara cubierta y dejar secar al aire durante 5 minutos. </li><li> Examinar las preparaciones con un microscopio electrónico o tienda de las redes en una celda de la malla para el trabajo futuro. </li></ol> 3.Caracterización exosoma por citometría de flujo Como exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por el equipo actual de la citometría de flujo, es necesario unir primero los exosomas a cuentas recubiertas de anticuerpos (Figura 1). Estas cuentas pueden ser adquiridos como un producto ya hecho o en el laboratorio con el anticuerpo de elección. Dependiendo del origen celular exosomal, diferentes anticuerpos se pueden acoplar a los granos que pueden ser de carácter magnético o al látex. En la actualidad el uso anti-MHC de clase II o anti-CD63 bolas recubiertas de este análisis. <ol><li> Para el uso de los granos "casera" recubiertas de anticuerpos, utilizamos cuatro bolas de látex recubiertas con anticuerpos anti m-CD63 anticuerpos. Lavar 25 l 4 bolas de látex m (30 x 10 6 bolas) dos veces en 100 l tampón MES, 3 000 g durante 15-20 minutos y disolver el precipitado en 100 l tampón MES. Prepare la mezcla de anticuerpos que contiene un volumen igual de anticuerpo 12,5 mg con el mismo volumen de tampón MES. Agregue elcuentas a la mezcla de anticuerpos e incubar con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Lave las cuentas recubiertas de anticuerpos tres veces con PBS (3 000 g durante 20 minutos) y disolver el precipitado en 100 l de buffer de almacenamiento (con una concentración final de 300 000 cuentas / l). </li><li> Para cada muestra (cada anticuerpo), continuar con un volumen equivalente a un mínimo de 30 g de proteína exosomal (de los exosomas intacta resuelto en PBS) por ~ 100 000 perlas recubiertas de anticuerpos. </li><li> Incubar exosomas y cuentas, en un volumen total de 300 l de PBS, durante la noche a 4 ° C en el movimiento suave. </li><li> Bloque mediante la adición de 300 l de 200 mM glicina y se incuba durante 30 minutos. </li><li> Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado (suero de 1-3% en PBS), 600 g durante 10 minutos. </li><li> Incubar los complejos exosoma de perlas con 50 l de anticuerpos IgG a 4 ° C. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 90 l de solución de lavado y 10 lanticuerpos de la elección (lo ideal es anti-CD9 y anti CD63-CD81 o anti-) a los complejos exosoma de perlas y se incuba durante 40 minutos con movimientos suaves. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 300 l de solución de lavado y adquirir datos mediante citometría de flujo. </li></ol> Como se discutió cuentas anteriores, se pueden utilizar diferentes, tales como bolas de látex como se describe en el protocolo o partículas magnéticas. Si las bolas magnéticas se utilizan en su lugar, tenga en cuenta, que el protocolo es un poco diferente. El paso de bloqueo (punto 4) no es necesaria y el lavado se realiza colocando el tubo en un soporte magnético en lugar de una centrifugación. El buffer de almacenamiento utilizadas para las cuentas de "fabricación casera" recubiertas de anticuerpos, contiene 0,1% de glicina y sodio al 0,1% azid en PBS, con un pH de 7,2. Importante, asegúrese de utilizar el suero exosoma agotadas para el buffer de flujo de lavado de citometría de flujo (1-3% de suero en PBS), para evitar cualquierexosomas suero contaminantes en el análisis. Nota: al realizar la caracterización mediante el uso de anticuerpos exosoma cuentas junto es importante reconocer que es sólo una subpoblación específica, específica para los anticuerpos utilizados, es decir, aislado y caracterizado. 4. Detección exosoma por Western blot Western blot es un método bien establecido y no vamos a entrar en detalles sobre el método en sí, sino que se centran en la importancia de un adecuado aislamiento de las proteínas antes de la Western blot y los diferentes anticuerpos utilizados. <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de proteínas de la elección y pipeteo fondo, seguido por vórtice de mezclas. A fin de lisar los exosomas, sonicar la muestra en un baño de agua de 3 x 5 minutos con el vórtice de mezcla en el medio. Finalmente centrifugación de la muestra, 13 000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la transferencia del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. </li><li> Measuvolver a la proteína total por el método de elección y la carga de 20-50 g de proteína por cada pozo. </li><li> Separada y la transferencia de las proteínas mediante electroforesis en gel y electrotransferencia. </li><li> Bloquear y lavar la membrana antes de realizar la inmunotinción frente a las proteínas enriquecido en exosomas. </li><li> Detectar la proteína específica por quimioluminiscencia, sistema de imagen digital y software de análisis. </li></ol> Como no hay marcadores específicos exosoma, las proteínas que se enriquecen en los exosomas, de todos los orígenes celulares diferentes, se utilizan comúnmente para la detección de exosomas. Estas son las proteínas, tales como tetraspaninas (por ejemplo, CD9, CD63 y CD81), proteína del citoesqueleto asociados (por ejemplo, Ezrin) y proteínas implicadas en la biogénesis multivesiculares (por ejemplo, Tsg101 y Alix). Otras proteínas que también son comúnmente detectado en los exosomas son Flotillin, Hsc70 y diferentes proteínas Rab, etc Sin embargo, también hay células proteínas específicas que se encuentran en los exosomas como A33 (células epiteliales del intestino), CD3(Células T) y el MHC de clase II (células presentadoras de antígenos). Así, dependiendo de qué tipo de células a partir de los exosomas son liberados de los marcadores para la detección puede variar. Como otros compartimientos de la célula también puede producir vesículas, se recomienda también para determinar la presencia de proteínas de estos compartimentos como el retículo endoplasmático (por ejemplo, calnexina y grp78) y el aparato de Golgi (por ejemplo, GM130). Por lo tanto, la falta de estas proteínas indica poca o ninguna contaminación de las vesículas de otros compartimentos de la muestra estudiada. 5. El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de ARN de la elección y llevar a cabo la extracción de RNA. Diferentes kits de aislamiento de ARN se pueden utilizar dependiendo de los experimentos posteriores, pero los métodos basados ​​en la columna proporciona muestras con un espectro más amplio de la ARN. Actualmente estamos utilizando miRCURY kit de aislamiento de ARN Exiqon, pero otros equipos pueden ser adecuados en función de la scientific cuestión que nos ocupa. </li><li> Al realizar el aislamiento de ARN es importante trabajar en un ambiente libre de RNasa. Por lo tanto el uso de ácidos nucleicos y nucleasa consejos gratis pipeta y limpie tanto banquillo y el equipo libre de contaminantes y RNasas. </li><li> Para el aislamiento de ARN, mediante el uso de miRCURY kit de aislamiento de ARN, disolver el exosoma pellet en 350 l de solución de lisis y realizar vórtice de la mezcla durante 15 segundos. </li><li> Añadir 200 l de etanol al 95% y agitar la mezcla durante 10 segundos. </li><li> Coloque una columna en un tubo de recogida y transferencia de los exosomas lisis de la columna y centrifugar 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Lavar tres veces añadiendo 400 l de solución de lavado a la columna que contiene el ARN exosomal y centrifugar durante 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Centrifugar la columna durante 2 minutos a 14 000 xg para asegurarse de que la columna se seque y coloque la columna seca en un tubo libre de RNasa eppendorf. </li><li> Añadir 50 l de Tampón de Elución de la columna y centrifugar durante 2 minutos a 200 xg, seguido por 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Continuar con el ARN aislado o almacenarlo en -80 ° C. </li></ol> Para la detección y análisis de la ARN extraído exosomal total, use un Agilent 2100 Bioanalyzer con el ARN Nano 6000 o Kit ARN 6000 Pico. El análisis muestra que el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño. 6. Resultados representante Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por los métodos disponibles de citometría de flujo, y por lo tanto unido al anticuerpo revestida de piedras antes de ser analizados (Figura 1). Como exosoma de perlas complejos puede agregar la citometría de flujo diagrama de dispersión puede contener diferentes poblaciones de cuentas individuales, dobles y triples (Figura 2A). La flecha indica las cuentas individuales que se analizan más. A CD63 positivo solo grano-exosoma población en comparación con su control de isotipo se muestra en la Figura 2B. e_content "&gt; Debido al pequeño tamaño de los exosomas, que sólo se pueden visualizar directamente con el microscopio electrónico, y no por microscopía de luz. típicas características morfológicas de los exosomas son de forma redonda y 30-100 nm de tamaño vesículas de membrana. En la figura 3, la microscopía electrónica fotografías muestran exosomas immunostained (A) con el oro-anticuerpo marcado para CD63 (indicado por la flecha) y no immunostained exosomas (B). Para determinar que las vesículas aisladas son de hecho los exosomas y para caracterizar las proteínas exosomal, Western blot se usa comúnmente. La figura 4 muestra la ausencia de calnexina, un marcador de retículo endoplásmico. Esto indica poca contaminación de las vesículas del retículo endoplasmático. Por otra parte, la Figura 4 se muestra la presencia de CD81 en los exosomas, que es un tetraspanin comúnmente enriquecidos en exosomas. ARN celular contienen principalmentes del RNA ribosomal (rRNA), visto como los dos picos prominentes para el 18S y 28S rRNA subunidades en un análisis de Bioanalyzer (Figura 5). Sin embargo, el ARN exosomal difieren en su perfil como exosomas carecen de los dos picos rRNA (18S y 28S) y se enriquecen en el ARN corto como ARNm y miRNA (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Debido al pequeño tamaño de los exosomas (30-100 nm), que no se puede distinguir el ruido de fondo y cuando se analizaron por citometría de flujo. Por lo tanto, es necesario para la fijación de perlas recubiertas de anticuerpos antes de los exosomas son analizadas, lo que puede ser visualizado por el láser. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Las cuentas exosoma complejo puede agregar con cuentas dobles y triples entre sí y la forma (A). La flecha está demostrando el único cordón-exo algunos grupos de población que está cerrada y se utiliza para su posterior análisis. Esta población se pueden comparar directamente a un control de isotipo (gris lleno de pico) para determinar la presencia de moléculas de la membrana de los exosomas. CD63 positivo exosomas (pico abierto negro) se muestran en la figura B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Micrografías electrónicas de exosomas con la morfología y el tamaño típico (40-80 nm) (A y B). La flecha en el gráfico A se indica la partícula de oro de la secundaria de anticuerpos, verificando que esta exosoma han CD63 en la superficie de la membrana. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Western blot resultados que demuestren la ausencia de la proteína del retículo endoplásmico calnexina pero la presencia de la proteína común enriquecido en los exosomas, tetraspanin CD81. ve_content "&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Bioanalyzer resultados muestran la presencia de ARN en las células (A) y exosomas (B). Las flechas indican el 18S y 28S rRNA subunidades presentes en las células. Como exosomal varonil ARN contienen ARN pequeños rRNA poco o nada se identifica en los exosomas.

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JL es una co-propietario de una patente relacionada con la utilización de los exosomas como vectores para la transferencia de ARN en las células.

Al estudiar el contenido molecular y / o la función de los exosomas, es fundamental utilizar un método de aislamiento de alta calidad que proporciona un rendimiento adecuado y el grado más bajo posible de la contaminación. La metodología descrita en este trabajo es un enfoque bien establecido para aislar los exosomas y estudiar su contenido de ARN y función biológica. Por otra parte, la importancia de la caracterización de los exosomas aislados, por una combinación de diferentes métodos, incluyendo la microscopía electrónica, citometría de flujo y Western blot, se pone de relieve. Al aislar los exosomas, en la primera centrifugación (300 xg) se utiliza para precipitar las células que pueden estar presentes en la suspensión de células o el líquido estudiado biológica. La segunda centrifugación a 16 500 xg necesita ser lo suficientemente fuertes para precipitar las células muertas, escombros más grandes, cuerpos apoptóticos y otros organelos. Después de la centrifugación, algunos protocolos incluyen una etapa de nanofiltración, pero algunos investigators han excluido a este paso. Sin embargo, hacemos hincapié en la importancia de los fragmentos de la erradicación y de las vesículas de más de 200 nm, por lo que recomendamos como una etapa de filtración. Si un aislamiento más estrictas que se necesita, a 100 nm filtros se pueden utilizar, pero tenga en cuenta que si se utilizan fluidos viscosos, estos filtros pueden obstruirse y material exosomal se pierde. Además, un sistema de filtración de 100 nm puede afectar a la morfología de los exosomas y, además, si exosomas son a mayor escala que se pueden perder. Por lo tanto, los 200 nm filtros parece apropiado para el aislamiento exosoma. Después de la filtración, la ultracentrifugación obligatoria a 120.000 xg se utiliza para que sedimenten las exosomas. Los exosomas se pueden seguir lavadas con PBS, unida a las microesferas recubiertas de anticuerpo y se lavó, o colocado en un gradiente de sacarosa para eliminar las proteínas contaminación. Sin embargo, esto puede ser un proceso muy lento de los recursos que sostienen que no es necesario, especialmente si el volumen de la muestra inicial es pequeña y / o el contenido de ARN of los exosomas es baja, como medidas adicionales disminuirá sustancialmente el material adicional. Sin embargo, una vez más, la naturaleza de las vesículas aisladas deberían ser probadas por la presencia y la ausencia de ciertas proteínas. Hasta la fecha, ningún marcador de proteínas absolutamente único de los exosomas ha sido identificado para verificar que la muestra contiene exosomas y nada más. Como resultado, una combinación de métodos son necesarios para caracterizar los exosomas, incluida la determinación del tamaño y la morfología de los exosomas por microscopía electrónica. Además, la pureza de la muestra se puede determinar mediante microscopía electrónica, ya que este método puede proporcionar una visión general del nivel de contaminación de la muestra, por ejemplo, con grandes vesículas, como por ejemplo micropartículas, cuerpos apoptóticos o restos celulares. Además, el contenido proteico de los exosomas se puede determinar por citometría de flujo y Western blot, y la combinación de estos dos métodos da como resultado un análisis tanto de la unida a la membrana (por ejemplo, CD63 yCD81) e internalizado las proteínas (por ejemplo, Tsg101 y Alix) de los exosomas. Detección de proteínas enriquecido en los exosomas, como CD63, Tsg101 y Alix, y la ausencia de proteínas tales como el retículo endoplasmático proteína calnexina, es una indicación de que el exosoma pellet enriquecido es de hecho exosomas y no contaminar las vesículas de los otros compartimientos de la célula. El perfil de los ARN que se detecta en los exosomas es fundamentalmente diferente a la del ARN que se encuentran en las células intactas. Por lo tanto, el ARN exosomal analizados por Bioanalyzer o en gel a base de los enfoques de análisis de ARN carecen de los dos picos del 18S y 28S rRNA subunidades, que ocupan un lugar destacado en el análisis del ARN celular. Por lo tanto, argumentan que la detección de cantidades significativas de rRNA en una muestra indica que el ARN total extraído no es de origen exosomal solo, y por lo tanto que el método de aislamiento es necesario mejorar la calidad y la seguridad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Aislamiento exosoma </td></tr><tr><td> Optima L-90K ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-sello de tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Dependiendo del rotor utilizado diferentes tubos se necesitan. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-el sello del tubo inalámbrico Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Filtro de jeringa, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Para fluidos viscosos y / o grandes volúmenes, un sistema de filtración al vacío, 0,2 m, de VWR International se puede utilizar en su lugar (514 a 0600). </td></tr><tr><td> De microscopía electrónica </td></tr><tr><td> Formvar / rejillas de níquel recubierto de carbono </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD63 humano </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Control de isotipo, IgG1k (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-ratón conjugado de oro, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Final de conc: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega microscopio electrónico </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> Citometría de flujo </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfato de látex cuentas </td><td> Dinámica interfacial </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos para el recubrimiento de las perlas de látex </td><td></td><td></td><td> Por ejemplo, anti-CD63 de BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> Elmi </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> IgG de suero humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Para la detección de anticuerpos </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Por ejemplo: anti-CD63 PE (556.020) PE anti-CD9 (555.372) de control de isotipo anti-CD81 PE (555,676) (555,749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN </td></tr><tr><td> miRCURY ARN Kit de aislamiento </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de arn que contienen exosomas

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

El campo de la investigación exosoma se está expandiendo rápidamente, con un aumento dramático en las publicaciones en los últimos años. Estas pequeñas vesículas (30-100 nm) de origen endocítica se propuso por primera vez de funcionar como una forma de reticulocitos para erradicar el receptor de transferrina, mientras que en los eritrocitos de maduración 1, y fueron nombrados después exosomas. Exosomas se forman por gemación interna de la tarde endosomes, la producción de cuerpos multivesiculares (MVBs), y se liberan en el medio ambiente por la fusión de la MVBs con la membrana plasmática 2. Desde el primer descubrimiento de exosomas, una amplia gama de células se ha demostrado que la liberación de estas vesículas. Exosomas también se han detectado en varios fluidos biológicos, como el plasma, el líquido lavado nasal, saliva y leche materna 3-6. Además, se ha demostrado que el contenido y la función de exosomas depende de la célula de origen y las condiciones en que se producen. Una variedad de funciones han sido los demoniosconcentrada de exosomas, tales como la inducción de tolerancia frente a alergenos 7,8, la erradicación de tumores establecidos en ratones 9, la inhibición y la activación de las células asesinas naturales 10-12, la promoción de la diferenciación en las células T reguladoras 13, la estimulación de la proliferación de células T 14 y la inducción de la apoptosis de las células T 15. Año 2007 se demostró que los exosomas liberados de los mastocitos contienen ARN mensajero (ARNm) y microRNA (miRNA), y que el ARN puede ser trasladado de una celda a otra a través de exosomas. En las células receptoras, el ARNm transportados por exosomas ha demostrado ser traducido a proteínas, lo que sugiere una función reguladora de la ARN transferido 16. Además, también hemos demostrado que los exosomas derivados de las células cultivadas en el estrés oxidativo puede inducir tolerancia frente al estrés adicional en las células receptoras y por lo tanto sugieren una función biológica de la lanzadera exosomal ARN 17. Medios de cultivo celular y co fluidos biológicosntain una mezcla de vesículas y arrojar fragmentos. Un método de aislamiento de alta calidad para los exosomas, seguido por la caracterización e identificación de los exosomas y su contenido, por lo tanto, es crucial distinguir exosomas de otras vesículas y partículas. A continuación, presentamos un método para el aislamiento de los exosomas de ambos medios de cultivo de células y fluidos corporales. Este método de aislamiento se basa en la centrifugación repetida y etapas de filtración, seguida de una etapa ultracentrifugación final en el que los exosomas se precipitan. Métodos importantes para identificar los exosomas y caracterizar la morfología exosomal y contenido de proteína se ponen de relieve, incluso la microscopia electrónica, citometría de flujo y Western blot. La purificación del RNA exosomal total se basa en la cromatografía de columna de giro y el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño se analizaron mediante un Bioanalyzer.

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

El campo de la investigación de los exosomas se está expandiendo rápidamente, con un aumento drástico de las publicaciones en los últimos años. Estas pequeñas vesículas (30-100 nm) de ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar si las células y el líquido biológico de interés liberan o contienen exosomas que poseen ARN. El primer paso para aislar los exosomas consiste en eliminar las células y los restos celulares. A continuación, se filtra el sobrenadante para eliminar partículas más grandes.Luego, los exosomas se pelletizan mediante ultracentrifugación como segundo paso. Los exosomas se caracterizan mediante microscopía electrónica, citometría de flujo y análisis de sangre por inmunotransferencia para demostrar que las vesículas aisladas poseen la morfología, tamaño y composición proteica de los exosomas. A continuación, se aísla el ARN de los exosomas purificados.Con el fin de determinar qué ARN contienen los exosomas, los resultados obtenidos mediante estos métodos bien establecidos de purificación, detección y caracterización de exosomas pueden facilitar estudios posteriores sobre los exosomas, como sus funciones biológicas. Por lo tanto, esta presentación mostrará cómo se pueden aislar los exosomas mediante diferentes métodos, y las dos personas que lo presentarán son mis dos estudiantes de doctorado, Maria, El y Cecelia. Eh. Buena suerte.La línea celular masónica humana, HC uno, se utiliza para esta demostración de aislamiento de exosomas para comenzar el procedimiento de aislamiento de exosomas. Primero, cultive las células en medio con suero libre de exosomas. Luego, transfiera la suspensión celular a tubos cónicos y centrifugue a 300 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Para obtener el sedimento celular, transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga y centrifugue la muestra a 16.500 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar más células y restos celulares. A continuación, filtre el SANE a través de un filtro de 0,2 micrones para eliminar partículas mayores de 200 nanómetros. Finalmente, se sellan los tubos de ultracentrífuga que contienen el SANE filtrado y se someten a ultracentrifugación a 120.000 ×g durante 70 minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sedimento de exosomas.Los exosomas se recuperan abriendo el tubo de ultracentrífuga, descartando el sobrenadante y resuspendiendo el precipitado enriquecido en exosomas. Para una recuperación máxima de exosomas, resuspenda repetidamente el precipitado enriquecido en exosomas en un pequeño volumen de un tampón adecuado en un tubo eppendorf.Lave dos veces con tampón adicional del mismo volumen que el anterior. El tampón depende del tipo de experimentos posteriores al aislamiento de exosomas. Para microscopía electrónica, utilice aproximadamente 10 microgramos de proteína exosómica de los exosomas íntegros.Se realizó la resuspensión en PBS. Nuestra microscopía electrónica con rejilla de níquel recubierta de carbono puede realizarse sin inmunotinción, ya que las exosomas pueden identificarse únicamente en función de su morfología y tamaño. Sin embargo, se recomienda utilizar un anticuerpo primario como anti-CD63 o anti-MHC clase II, seguido de anticuerpos secundarios marcados con oro de 10 nanómetros.Dado que los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por los equipos actuales de citometría de flujo, es necesario primero unir los exosomas a perlas recubiertas con anticuerpos. Dependiendo del origen celular de los exosomas, se acoplan diferentes anticuerpos a perlas magnéticas o de látex. En esta demostración, se utilizarán perlas de látex recubiertas con anticuerpo anti-CD63 para cada muestra.Utilice un volumen equivalente a 30-40 microgramos de proteína exosomal del exosoma intacto. Suspenda los exosomas en PBS e incube con las perlas durante la noche a cuatro grados Celsius con movimiento suave. Al día siguiente, bloquee añadiendo 300 microlitros de glicina 200 milimolar e incube durante 30 minutos.Lave el complejo de microesferas con exosomas dos veces y luego incube los complejos de microesferas con exosomas con 50 microlitros de anticuerpo IgG a cuatro grados Celsius. Lave los complejos de microesferas con exosomas dos veces, agregue 90 microlitros de tampón de lavado y 10 microlitros del anticuerpo de elección a los complejos de microesferas con exosomas e incube durante 40 minutos a oscuras. Bajo agitación suave, lave los complejos de microesferas con exosomas dos veces, agregue 300 microlitros de tampón de lavado y transfiera las muestras a tubos para citometría de flujo y adquiera los datos mediante citometría de flujo.Esta demostración de inmunotransferencia (Western blot) se centrará en la importancia de un aislamiento proteico adecuado antes del Western blot y en los diferentes anticuerpos utilizados. Disuelva el pellet de exosomas en el tampón de lisis proteica de elección y pipetee completamente, seguido de mezcla por vortex para lisar aún más los exosomas, someta la muestra a sonicación en un baño de agua, centrifugue la muestra a 13.000 × g durante cinco minutos y transfiera el SANE a un nuevo tubo eppendorf. Mida la proteína total mediante un método de elección y cargue la proteína en el gel.Luego separe y transfiera las proteínas mediante electroforesis en gel y transferencia electroforética, bloquee y lave la membrana antes de realizar la inmunotinción contra proteínas enriquecidas en exosomas, ya que no existen marcadores específicos para exosomas. Las proteínas enriquecidas en exosomas procedentes de diferentes orígenes celulares se utilizan comúnmente para la detección de exosomas. Estas son proteínas como las tetraspaninas, por ejemplo, CD9, CD63 y CD81.Proteínas asociadas al citoesqueleto como la ezrina y proteínas implicadas en la biogénesis de multivesículas como TSG 1 0 1 y LY como control negativo para verificar la presencia de proteínas contaminantes comúnmente encontradas en vesículas de otros compartimentos, tales como la quexina y la GRP 78 del retículo endoplasmático. Se pueden utilizar diferentes kits de aislamiento de ARN según los experimentos previstos. En esta demostración, se empleará un método basado en columnas durante el aislamiento de ARN.Es importante utilizar puntas de pipeta libres de ácidos nucleicos y nucleasas, y limpiar tanto el banco de trabajo como el equipo para eliminar contaminantes y ARN. Disuelva el precipitado de exosomas en 350 microlitros de solución de lisis y vortexee la muestra. Añada 200 microlitros de etanol al 95 % y mezcle utilizando un vórtex.Coloque una columna en un tubo de recolección y transfiera los exosomas lisados a la columna y centrifugue. Lave tres veces con 400 microlitros de solución de lavado para asegurarse de que la columna esté seca. Centrifugue durante dos minutos a 14,000 × g después del último lavado y coloque la columna seca en un tubo eppendorf libre de RNAsas. Eluya el ARN en 50 microlitros de tampón de elución para la detección y análisis del ARN total extraído de exosomas.Un bioanalizador Agilent 2100 puede utilizarse con el kit RNA 6,000 nano o RNA 6,000 pico, ya que los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados mediante los métodos disponibles de citometría de flujo. Se unen a perlas recubiertas con anticuerpos antes de ser analizados. Dado que estos complejos de exosomas y perlas pueden agregarse en la citometría de flujo, el diagrama de dispersión puede contener diferentes poblaciones de complejos de perlas con un solo exosoma, dobles o triples.Como se muestra aquí, la flecha indica la población de complejos de partículas individuales de exosomas, que es la población que se analiza posteriormente. Un histograma de citometría de flujo muestra una población de partículas de exosomas individuales positiva para la proteína CD63. Cuanto más hacia la derecha se encuentre la curva abierta, más positiva será la muestra para CD63.Debido al pequeño tamaño de los exosomas, solo pueden visualizarse mediante microscopía electrónica. Las características morfológicas típicas de los exosomas incluyen vesículas redondeadas de tamaño entre 30 y 100 nanómetros. Se muestra una inmunotinción de exosomas con anticuerpo marcado con oro coloidal para CD63, indicado por la flecha en el inmunotransferencia.Los resultados muestran la ausencia de la proteína del retículo endoplásmico calnexina en la muestra exosomal, pero revelan la presencia de la tetraspanina CD81, una proteína comúnmente enriquecida en exosomas. El ARN celular contiene principalmente ARN ribosomal, observado como dos picos correspondientes a la subunidad de ARN ribosomal 18S ubicada a la izquierda y la subunidad 28S ubicada a la derecha en este análisis mediante bioanalizador. Sin embargo, los ARN exosomales difieren en sus perfiles, ya que contienen poca o ninguna cantidad de ARN ribosomal y están enriquecidos en ARN cortos, como el ARN mensajero y el ARN micro. Una vez dominado.El aislamiento de puede realizarse en aproximadamente tres horas si se hace correctamente. Al utilizar este método, es importante realizar todos los pasos, incluida la no presentación, para evitar la contaminación de ics más grandes. Después del desarrollo de esta técnica, se ha vuelto mucho más fácil caracterizar los exosomas, tanto bioquímicamente como biológicamente.Además, hemos aprendido mucho más sobre la comunicación entre células mediada por exosomas en diferentes sistemas. Asimismo, la técnica ha permitido desarrollar los exosomas como biomarcadores para diversas enfermedades. Muchas gracias por su atención.

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La presencia de microRNAs estables (miRNAs) en exosomas ha generado gran interés como un nuevo modo de comunicación intercelular, por su utilidad potencial como marcadores biológicos y como una ruta para la intervención terapéutica. Aquí se demuestra la purificación de exosomas sanguíneos y medios de cultivo seguido de PCR cuantitativa para identificar miRNAs que se transportan.

Purificación y microRNA perfiles de exosomas derivados de la sangre y Cultura Medios

Se describen técnicas que describen un procedimiento de gradiente para separar exosomas de partículas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Este procedimiento se utilizó para aislar exosomas de partículas de VIH en plasma humano de individuos infectados por el VIH. Los exosomas aislados se analizaron para determinar el contenido de citocinas/quimiocinas.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

El líquido biliar es una valiosa fuente de vesículas/exosomas extracelulares que contienen biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa un método sólido para aislar exosomas de la bilis humana para análisis posteriores, incluido el perfil de miARN.

El aislamiento y la generación de perfiles de exosomas de la bilis humana que contiene microRNA

Se describe un procedimiento de aislamiento de RNA tándem (viaje) para la recuperación de complejos proteicos de ARNm endógeno formado. Específicamente, complejos RNA-proteína son reticulado en vivo, cofia RNAs son aislados de los extractos con los granos oligo(dT) y particular mRNAs son capturados con oligonucleótidos antisentido de RNA modificados. Proteínas a mRNAs son detectadas por el análisis de immunoblot.

Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

Aquí, describimos a dos protocolos de aislamiento de vesículas extracelulares, ultrafiltración centrifugación y ultracentrifugación con centrifugación gradiente de densidad, para aislar las vesículas extracelulares de muestras de líquidos de lavado broncoalveolar murino. Las vesículas extracelulares derivadas del líquido de lavado broncoalveolar murino por ambos métodos se cuantifica y caracteriza.

Aislamiento de las vesículas extracelulares del líquido de lavado broncoalveolar murino utilizando una técnica de centrifugación ultrafiltración

Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.

Aislamiento, secuenciación y análisis de microRNA extracelular de las células madre mesenquimales humanas

Un exosomas es una nueva generación de compañías de entrega de drogas. Hemos establecido un protocolo de aislamiento de exosomas con alto rendimiento y pureza para entrega de siRNA. También había encapsulado con fluorescencia inespecífica siRNA en exosomas y había investigado la absorción celular de exosomas cargado de siRNA en las células cancerosas.

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Aquí, presentamos un protocolo para aislar exosomas derivados del bazo de ratón utilizando una combinación de digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación.

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Aprenda a aislar y caracterizar exosomas que contienen ARN mediante ultracentrifugación, microscopía electrónica y citometría de flujo. Estas técnicas permiten analizar el contenido molecular de vesículas extracelulares en estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

Explorar más videos