JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:15 min • July 8th, 2025
Los glicosaminoglicanos sulfatados como los sulfatos de heparán, HS, son polisacáridos sulfatados, lineales y cargados negativamente de longitudes de cadena variable, unidos a proteínas de la superficie celular.
Para estimar HS de diferentes longitudes aisladas del tejido pulmonar de ratón, comience con el ensamblaje del casete de gel. Llénelo parcialmente con una solución de acrilamida-bisacrilamida altamente concentrada, incluidos los agentes catalizadores: persulfato de amonio y tetra-metil-etilendiamina. Cubra con agua para evitar el contacto con el aire, lo que puede inhibir la polimerización. Incubar.
Los agentes catalizadores inducen la polimerización de la acrilamida-bisacrilamida, formando un gel de resolución de poros pequeños. Deseche el agua. Agregue una solución de acrilamida-bisacrilamida baja concentración con agentes catalizadores. Inserte un peine de gel para crear pozos. La solución polimeriza, formando un gel de apilamiento de poros grandes.
Cargue las cámaras del tanque de electroforesis con un tampón de funcionamiento para una conductividad eléctrica óptima durante la electroforesis.
Disuelva la mezcla de HS en un tampón de carga que contenga colorante de seguimiento y sacarosa. A continuación, transfiera esta mezcla y las escaleras HS estándar a los pocillos de casete. La sacarosa confina la mezcla a los pozos. El tinte ayuda a controlar la progresión de la electroforesis.
Iniciar electroforesis a bajo voltaje. Los HS cargados negativamente atraviesan el gel de apilamiento, moviéndose hacia el ánodo cargado positivamente y se concentran en la interfaz de gel de apilamiento-resolución debido a la diferencia de tamaño de poro.
Aumente el voltaje. Los HS de cadena pequeña migran rápidamente a través del gel de resolución, atravesando más lejos, mientras que los HS de cadena larga quedan atrapados dentro de la matriz del gel y se mueven lentamente.
Después de la electroforesis, tiñe el gel. Los SA aparecen como bandas distintas, con los SA de cadena pequeña colocados más bajos que los HS de cadena larga. La longitud de los SA individuales se puede determinar comparándola con los estándares de HS.
Comience colocando un casete vacío en el tanque PAGE. Moldee el gel de resolución mezclando 10 mililitros de solución de gel de resolución con 60 microlitros de persulfato de amonio al 10% recién preparado en un tubo de 15 mililitros. Luego, agregue 10 microlitros de TEMED. Invierta el tubo suavemente de 2 a 3 veces.
Agregue rápidamente 10 mililitros de la solución de gel de poliacrilamida activada al casete con una pipeta. Cubra con 2 mililitros de agua filtrada desionizada y deje que el gel de resolución polimerice durante 30 minutos.
Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta. Moldee el gel de apilamiento mezclando 3 mililitros de solución de gel de apilamiento con 90 microlitros de persulfato de amonio al 10% recién preparado en un tubo de 15 mililitros. Luego, agregue 3 microlitros de TEMED e invierta el tubo suavemente de 2 a 3 veces.
Utilice una pipeta para añadir rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado, hasta que el casete esté lleno hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con el casete de gel de poliacrilamida vacío y deje que el gel de apilamiento polimerice durante 30 minutos. Una vez que el gel se haya polimerizado, retire la tira de cinta de la parte inferior del casete y vuelva a colocar el casete en el conjunto del tanque PAGE. Llene las cámaras superior e inferior con las respectivas soluciones tampón.
Disuelva las muestras secas de glicosaminoglicanos en el volumen mínimo necesario de agua filtrada desionizada y mezcle con el tampón de carga de muestras en una proporción de 1 a 1. Cargue las muestras y las escaleras de oligosacáridos HS en el gel.
Vuelva a ejecutar el gel durante 5 minutos a 100 voltios. Luego, hágalo funcionar a 200 voltios durante 20 a 100 minutos, dependiendo del porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución.