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Técnicas biológicas
0 vistas • 5:34 min • July 8th, 2025
Para comenzar, tome una muestra que contenga oligonucleótidos de ARN fosforilados y no fosforilados marcados con fluorescencia mezclados con el colorante de carga que contiene urea. Calentar la muestra.
La urea, un fuerte desnaturalizante, en combinación con el calor desnaturaliza la estructura secundaria del ARN, lo que da como resultado su conformación linealizada y no estructurada. Ahora, moldee el gel mezclando una solución de acrilamida-bisacrilamida con urea.
Agregue tetrametileno diamina, un catalizador, y persulfato de amonio, un agente oxidante, para facilitar la polimerización posterior en gel.
Vierta la solución en un aparato de casete preensamblado. Inserte un peine, creando pocillos para la carga de muestras. Deje que el gel se polimerice. Coloque el casete en el aparato de gel. Agregue un amortiguador de funcionamiento a los depósitos superior e inferior, manteniendo el flujo de corriente a través de todo el gel. Retire el peine.
Cargue la muestra mezclada con tinte de visualización en el pocillo y conecte el gel a una fuente de alimentación al voltaje deseado. La urea en el gel permite que las moléculas de ARN migren como especies lineales.
El gel actúa como un tamiz, permitiendo que las moléculas de ARN cargadas negativamente se muevan a través de los poros hacia el electrodo positivo. Durante la ejecución, el ARN fosforilado, que es inherentemente más negativo, se mueve más rápido que el ARN no fosforilado.
Imagen del gel para la detección de ARN marcado con fluorescencia. Observe el cambio de movilidad entre el ARN fosforilado de migración más rápida, que aparece como una banda inferior en comparación con el ARN no fosforilado.
Para preparar una solución de gel de acrilamida desnaturalizante al 15%, combine 22,5 mililitros de solución premezclada de acrilamida/bis-acrilamida al 40% 29:1, 6 mililitros de 10X TBE, 28,8 gramos de urea y agua libre de ARNasa hasta un volumen total de 59 mililitros. Luego, revuelva suavemente la solución.
Caliente la solución en el microondas durante 20 segundos, revuélvala e inmediatamente devuélvala al microondas durante otros 20 segundos. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo. Coloque el vaso de precipitados de vidrio en un baño de agua poco profundo, que contenga agua fría, durante 5 minutos, asegurándose de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de vidrio esté por encima del nivel de solución dentro del vaso de vidrio. Cuando la solución esté fría, filtre y desgasifique con una unidad de filtración desechable de 0,22 micrómetros para eliminar las partículas y las burbujas de aire microscópicas.
Lave un plato de vidrio corto y largo con agua y jabón. Luego, rocíe cada placa con etanol al 95% y limpie el vidrio para eliminar la humedad. Eleve el plato largo de la parte superior del banco colocándolo encima de una caja. Luego, coloque espaciadores de 0,4 milímetros a lo largo de los bordes largos de la placa. Coloque la placa corta encima de la placa larga, asegurándose de que los bordes de la placa corta, la placa larga y los espaciadores estén alineados. Luego, sujete cada lado con tres abrazaderas de metal espaciadas uniformemente.
Agregue 24 microlitros de TEMED a la solución de acrilamida y mézclelo. Luego, agregue 600 microlitros de APS al 10% e inmediatamente vierta la solución entre las placas de vidrio.
Verter la solución de acrilamida entre el sándwich de placa de vidrio puede ser realmente desafiante. Para evitar las burbujas de aire, golpea el sándwich de placa de vidrio mientras viertes la solución.
Con cuidado, agregue un peine limpio de 32 pocillos en la parte superior del sándwich de placa de vidrio y deje que la acrilamida polimerice durante 30 minutos.
Para ejecutar el gel, ajuste el bloque de calor a 75 grados centígrados, retire las abrazaderas de metal y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio. Coloque el sándwich de placa en el aparato de gel con la placa corta hacia adelante y prepare un tampón de funcionamiento de 0,5X TBE combinando 100 mililitros de 10X TBE con 1,9 litros de agua libre de ARNasa.
Agregue 600 mililitros del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato. Retire suavemente el peine del gel y enjuague bien los pocillos con una jeringa. Ejecute previamente el gel a 50 vatios durante 30 minutos. Luego, enjuague los pocillos nuevamente.
Haga girar por pulsos las reacciones apagadas e incube a 75 grados Celsius durante 3 minutos. Repita el centrifugado del pulso e inmediatamente cargue 10 microlitros de cada muestra en el gel. Luego, haga funcionar el gel durante 3 horas a 50 vatios. Cuando haya terminado la carrera, apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato.
Lave y seque el lado exterior del sándwich de placa de vidrio. Luego, cúbralo con papel de aluminio y transfiéralo a un escáner láser para obtener imágenes. Monte el sándwich de placa de vidrio en la platina del escáner láser, configure las longitudes de onda de excitación y emisión para el fluoróforo deseado y obtenga una imagen del gel.