Electroforesis bidimensional semidesnaturalizante en gel de agarosa: una técnica para separar fibras de amiloide polimórficas en función de la heterogeneidad de tamaño

Las fibras amiloides son agregados de proteínas mal plegadas, que exhiben heterogeneidad de tamaño. Estas fibras, al ser resistentes a detergentes aniónicos como SDS, se pueden analizar mediante electroforesis bidimensional en gel de agarosa semidesnaturalizante.

Para comenzar, tome un gel de agarosa preensamblado del tamaño de un poro grande que contenga SDS. La alta porosidad permite la separación de fibras intactas durante la ejecución. Superponga el gel con un tampón de funcionamiento que contenga SDS.

Cargue un lisado celular que contenga fibras amiloides en el gel. La presencia de SDS y la ausencia de paso de calentamiento de la muestra crea condiciones semidesnaturalizantes en las que el detergente se une a amiloides altamente resistentes impartiendo una carga negativa uniforme a las fibras intactas.

Ejecute el gel en la primera dimensión al voltaje apropiado. El campo eléctrico provoca la migración de amiloides cargados negativamente hacia el ánodo cargado positivamente.

Durante la ejecución, las fibras más pequeñas migran rápidamente en comparación con las más grandes, formando un patrón de banda similar a una mancha que indica heterogeneidad de tamaño.

Al finalizar, gire el gel perpendicularmente y ejecútelo en la segunda dimensión. En esta dimensión, las fibras se mueven de manera idéntica a la primera corrida separándose según sus tamaños. Esto crea una mancha diagonal a medida que las fibras más pequeñas migran más rápido que las más grandes.

La formación de la banda diagonal aguda confirma una población fibrilar amiloide intacta pero heterogénea.

Para preparar el gel, agregue 2 gramos de polvo de agarosa a 200 mililitros de tampón TAE en un vaso de precipitados de vidrio. Luego, calienta el vaso de precipitados en un microondas para derretir la agarosa.

A continuación, agregue 1 mililitro de SDS al 20% a una concentración final de 0.1%. Agite suavemente el vaso de precipitados.

A continuación, vierta la agarosa líquida en una losa de gel de 15 cm x 14 cm. Para eliminar las burbujas de aire, utilice una pipeta de 1 mililitro. Luego, coloque un peine de 20 pocillos encima del gel.

A continuación, agregue aproximadamente 60 microgramos de lisado de células enteras en el carril derecho del gel. Ejecute el gel a 60 voltios durante aproximadamente cuatro horas, utilizando el tampón TAE que contiene 0.1% SDS, como tampón de funcionamiento.

Para ejecutar el gel en la segunda dimensión, gírelo con cuidado 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj. Luego, haga funcionar la cárcel a 60 voltios durante unas cuatro horas.