Electroforesis capilar: una técnica para analizar amplicones de reacción en cadena de la polimerasa marcados con fluorescencia

Para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN mediante electroforesis capilar, comience tomando una placa de ensayo de pocillos múltiples. Cada pocillo contiene amplicones de PCR marcados con fluorescencia y de diferentes tamaños: oligonucleótidos de ADN bicatenarios obtenidos después de un ciclo de PCR.

Agregue algunos fragmentos de ADN de doble cadena de diferentes tamaños al pozo, que actúan como un estándar de tamaño. Cada una de estas moléculas de ADN lleva una etiqueta fluorescente para una fácil identificación.

Complemente el pozo con formamida, un desnaturalizante fuerte, y caliente a alta temperatura. Este paso desnaturaliza el ADN, formando fragmentos monocatenarios que pueden migrar fácilmente a través de los poros del gel.

Coloque la placa en una unidad analizadora de fragmentos que contenga gel de polímero preinyectado dentro de su sistema capilar.

Aplique un alto voltaje para introducir electrónicamente el ADN del pozo en el capilar de diámetro delgado en el cátodo, el extremo negativo. Las moléculas de ADN cargadas negativamente migran hacia el ánodo cargado positivamente. Las hebras de ADN más cortas enfrentan menos fuerza de fricción y se mueven más rápido a través del gel que las hebras de ADN más largas.

Durante la electromigración, el ADN cruza el camino del rayo láser, lo que hace que el tinte emita fluorescencia. Las señales de emisión del tinte son capturadas por un detector y luego se traducen en un electroferograma, un gráfico que representa cada ADN fluorescente como un pico individual de color diferente.

Compare el pico del fragmento de ADN desconocido con los picos de referencia para analizar su tamaño.

Después de la confirmación de los amplicones de PCR, use nuevas tiras o placas de PCR para diluir los productos de PCR 1 a 10 en agua purificada. Vórtice y centrifugue brevemente. Mientras trabaja en una vitrina de gases, prepare una mezcla maestra en un tubo de centrífuga que consiste en formamida y una solución estándar de tamaño de referencia.

De acuerdo con el número de productos de PCR a analizar, utilice volúmenes de reactivos, como se detalla en el manuscrito. Permita un volumen excedente del 10%.

Agite brevemente y distribuya 9,5 microlitros en pocillos individuales en una placa de PCR, apropiada para el sistema de electroforesis capilar disponible. Luego, agregue 0,5 microlitros de producto de PCR diluido. Selle y centrifugue brevemente.

Luego, cargue la placa que contiene las muestras en un termociclador de PCR y desnaturalice las muestras a 95 grados Celsius durante 3 minutos, antes de enfriarlas a 4 grados Celsius indefinidamente. Centrifugar a 1.000 x g durante 1 minuto. Retire con cuidado el sello y cargue la placa en un sistema de electroforesis capilar calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejecute electroforesis capilar por análisis de fragmentos utilizando reactivos según corresponda para el aparato de elección y ajuste las condiciones de ejecución de acuerdo con la descripción en el manuscrito.