Electroforesis en gel alcalino de una sola célula: una técnica sensible para la estimación cuantitativa del daño en el ADN en células cancerosas individuales después de la quimioterapia

Los agentes quimioterapéuticos inducen roturas de ADN de cadena simple y doble en las células cancerosas, causando daño al ADN y muerte celular.

Para cuantificar el daño del ADN, mezcle las células cancerosas tratadas con quimioterapia con agarosa fundida de bajo punto de fusión. Pipetea esta mezcla en portaobjetos de vidrio prerrecubiertos de agarosa. Deje que la agarosa fundida se solidifique, incrustando las células dentro de la matriz de gel porosa.

Tratar con un tampón de lisis que contenga altas concentraciones de detergentes y sales. Los detergentes solubilizan las membranas celulares y nucleares. Además, el alto contenido de sal elimina las proteínas histonas del ADN, dejando el ADN superenrollado adherido a la matriz nuclear.

Incubar en tampón de electroforesis alcalina. El ambiente alcalino hace que los superenrollamientos de ADN se desenrollen, exponiendo roturas de ADN de una sola hebra y doble hebra.

Coloque los portaobjetos en una bandeja de gel que contenga tampón de electroforesis. Iniciar electroforesis.

Al estar cargado negativamente, el ADN es atraído hacia el ánodo positivo. Los fragmentos de ADN dañados migran fuera del núcleo y viajan a través de la matriz de gel poroso, con fragmentos de mayor longitud moviéndose más lentamente que los fragmentos más cortos. Por el contrario, el ADN no dañado no migra fácilmente, permaneciendo dentro del núcleo.

Después de la electroforesis, tiña las células con una solución de colorante de ácido nucleico fluorescente. Las moléculas de tinte se unen al ADN.

Bajo un microscopio de fluorescencia, las células individuales que contienen ADN dañado exhiben una estructura de cometa fluorescente. La "cabeza" del cometa representa el ADN intacto, mientras que la "cola" comprende fragmentos de ADN dañados.

La longitud e intensidad de la "cola" del cometa indica la extensión del daño del ADN en células cancerosas individuales tratadas con quimioterapia.

Combine la suspensión celular con agarosa fundida de bajo punto de fusión al 1%, en una proporción de volumen de 1:10. Mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e inmediatamente pipetee 30 microlitros en un portaobjetos. Utilice el lateral de la punta de la pipeta para esparcir la mezcla de células de agarosa y asegurar la formación de una capa fina. Coloque los portaobjetos planos a 4 grados centígrados en la oscuridad durante 10 minutos. Sumerja los portaobjetos en una solución de lisis a 4 grados centígrados, en la oscuridad durante una hora o toda la noche.

Para el ensayo de cometa alcalino, retire suavemente los portaobjetos de la solución de lisis, drene el exceso de líquido y sumerja suavemente los portaobjetos en AES, en la oscuridad a 4 grados centígrados durante una hora para permitir que el ADN se desenrolle.

Agregue AES preenfriado en la bandeja de portaobjetos de electroforesis. No exceda los 0,5 centímetros por encima de los toboganes. Coloque las diapositivas en el interior y cúbralas con una tapa. Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación a 1 voltio por centímetro y funcione a 4 grados centígrados durante 30 minutos. Cuando se complete la electroforesis, drene el exceso de AES de los portaobjetos.

Sumerja suavemente los portaobjetos dos veces, en agua destilada a temperatura ambiente, durante cinco minutos cada vez. Después de eso, sumerja suavemente los portaobjetos en etanol al 70% a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Comience el procedimiento de tinción secando los portaobjetos en la oscuridad a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. A continuación, coloque de 50 a 100 microlitros de solución de tinción de ácido nucleico fluorescente verde en la agarosa seca de cada portaobjetos y tiñe durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Enjuague los portaobjetos brevemente en agua destilada y séquelos completamente a 37 grados centígrados en la oscuridad.