JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:21 min • July 8th, 2025
La electroforesis microfluídica es una técnica para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños dentro de microcapilares.
Para comenzar, tome un chip microfluídico de múltiples pocillos que tenga pocillos designados para la mezcla de polímero a base de gel y tinte fluorescente, muestras de ADN y una escalera de ADN de peso molecular conocido. Estos pozos están interconectados a través de una red de microcanales.
Dispense la mezcla de colorante en gel en los pocillos asignados. Ensamble el chip en una estación de cebado preequipada con una jeringa vacía. Presione el émbolo de la jeringa, aplicando presión para forzar la mezcla de gel y tinte en el microcanal de separación.
Retire la viruta y pipetee otros componentes en sus respectivos pocillos. Agregue un marcador, un estándar interno que calibra el tamaño de la muestra, a los pocillos que contienen la escalera y las muestras.
Inserte el microchip en un analizador de fragmentos para hacer funcionar el chip. Una vez dentro, el voltaje aplicado genera fuerzas electroforéticas, conduciendo la muestra desde el pozo hacia el microcanal de carga de muestras desde donde llega a la intersección transversal entre este canal y el canal de separación. La corriente eléctrica ayuda a que la muestra ingrese al microcanal de separación.
Las moléculas de colorante fluorescente intercalan fragmentos de ADN cargados negativamente que se mueven hacia el ánodo a diferentes velocidades electroforéticas en relación con su tamaño molecular: los fragmentos más pequeños migran más rápido que los más grandes. En consecuencia, los fragmentos se separan en bandas de diferentes tamaños que emiten fluorescencia.
Un detector basado en láser mide la fluorescencia de cada banda y la registra como un electroferograma que muestra ADN de diferentes tamaños como un pico distinto.
Antes de comenzar, lleve el concentrado de tinte de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificadas a temperatura ambiente. Configure la estación de cebado reemplazando la jeringa y ajustando la placa base. Luego, suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela a la posición superior.
Inicie el software de dimensionamiento y prepare la mezcla de tinte en gel. Agita el concentrado de tinte durante 10 segundos y gíralo hacia abajo. Luego, agregue 25 microlitros del tinte a un vial de matriz de gel y agite la solución para mezclar.
Transfiera la mezcla de tinte en gel a un filtro giratorio. Colóquelo en la centrífuga y gírelo durante 10 minutos a 1.500 veces g. Cuando esté listo para cargar la mezcla de colorante en gel, inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado y agregue 9 microlitros de la mezcla de tinte en gel en el pocillo marcado con "G".
Cierre la estación de cebado y asegúrese de que el émbolo esté colocado en la marca de 1 mililitro. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo, hasta que quede sujeto por el clip. Espere exactamente 30 segundos y luego suelte el clip. Espere 5 segundos más y luego tire lentamente del émbolo a la posición de 1 mililitro.
Abra la estación de cebado y agregue 9 microlitros de mezcla de tinte en gel en los pocillos marcados con "G". Agregue 5 microlitros de marcador en el pocillo marcado con un símbolo de escalera y cada uno de los 12 pocillos de muestra.
Agregue 1 microlitro de la escalera al pozo con el símbolo de la escalera y 1 microlitro del producto de PCR o agua a los pocillos de muestra. Agite el chip durante 1 minuto a 2,400 RPM. Insértelo en el bioanalizador y ejecute el chip en cinco minutos.