SDS no reductor PAGE: Un método para analizar complejos de proteínas multiméricas ligados a disulfuro

Las proteínas multiméricas se estabilizan mediante enlaces disulfuro intermoleculares covalentes entre sus residuos de cisteína, lo que es crucial para mantener su integridad estructural y funcional.

Para analizar dichos complejos mediante PAGE no reductor, tome la concentración deseada de proteínas estabilizadas con disulfuro. Agregue un tampón de muestra no reductor y caliente la muestra.

Este tampón contiene SDS, que imparte una carga negativa general a las proteínas, y un colorante de seguimiento para visualizar su movimiento en el gel. El tampón carece de cualquier agente reductor, lo que permite que los enlaces disulfuro permanezcan intactos, lo que facilita que el complejo multimérico permanezca intacto.

Cargue los complejos individuales en pocillos del gel de poliacrilamida del porcentaje deseado, preensamblado en un aparato de gel. Agregue una escalera de proteínas de tamaño conocido en otro pozo. Sumerja los pocillos en un búfer de funcionamiento basado en SDS y conecte el aparato a una fuente de alimentación.

La corriente eléctrica obliga a los complejos de proteínas cargados negativamente a moverse a través de los poros del gel hacia el ánodo, el terminal positivo. Dado que los complejos de proteínas están uniformemente cargados negativamente, la separación se produce en función del tamaño, donde los multímeros forman una banda prominente de mayor peso molecular en una posición específica.

Compare el tamaño de la banda de proteína separada con la escalera. La ausencia de bandas de menor peso molecular en el gel confirma la separación exitosa de los complejos multiméricos intactos.

Prepare 1 litro de tampón de funcionamiento 1X Tris-glicina mezclando 25 milimolares de Tris, 192 milimolares de glicina y 0,1% en peso por volumen SDS. A continuación, configure el aparato de ejecución SDS-PAGE.

Abra el paquete TGX SDS-PAGE prefabricado al 16% según el protocolo del fabricante y retire el casete. Retire el peine que recubre los pocillos y la cinta de la parte inferior del casete y coloque el gel en el aparato en funcionamiento. Llene la cámara con el tampón de funcionamiento 1X, hasta que los pocillos estén sumergidos en líquido.

Con una pipeta de plástico, enjuague los pocillos con el tampón de funcionamiento. Cargue las muestras en el gel junto con 10 microlitros del marcador estándar preteñido. Finalmente, ejecute el gel a 200 voltios hasta que el frente del tinte esté aproximadamente a 1 centímetro de la parte inferior del gel.