Enfoque isoeléctrico en fase líquida: una técnica de electroforesis para separar moléculas bioactivas del extracto crudo de Gymnema sylvestre

Comience con una celda IEF de enfoque isoeléctrico preensamblada, una unidad de electroforesis en fase líquida. Esta columna es una cámara porosa horizontal compartimentada con distintos terminales positivos y negativos en los extremos.

Ahora, tome el extracto de la planta que contiene una mezcla compleja de componentes cargados de manera diferente con diferentes puntos isoeléctricos, pI, un pH donde la carga neta de una molécula es cero.

El extracto se complementa con anfolitos de cargas variables que facilitan el fraccionamiento posterior de los componentes de la muestra.

Cargue el ejemplo en los puertos de carga de la columna. Actualmente, la columna IEF tiene un pH constante. A continuación, aplique alto voltaje para iniciar la electroforesis.

Bajo el campo eléctrico, los anfolitos solubles migran hacia electrodos con carga opuesta y establecen un gradiente de pH lineal a través de la columna. Los componentes de la muestra comienzan a migrar a través del gradiente de pH de la fase líquida, y los colocados a pH por debajo de su pI tienen una carga positiva neta.

Estos migran hacia el electrodo negativo hasta que los componentes alcanzan su pI, donde su carga se neutraliza y la migración se detiene. De manera similar, los componentes a pH por encima de su pI migran hacia el electrodo positivo y se detienen cuando alcanzan su pI. Esto separa los componentes de la muestra en función de su pI en compartimentos enfocados. Coseche las fracciones purificadas para su posterior análisis.

Agregue 0,6 gramos de extracto de la planta Gymnema sylvestre a 60 mililitros de agua destilada. Disuelva el extracto de la planta mezclándolo en un tubo de rodillo durante cinco minutos.

Para eliminar las partículas insolubles, centrifugar la solución a 10.000 x g durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un vaso de precipitados de vidrio de 150 mililitros y agregue anfolita para crear una solución al 1% por volumen, aproximadamente 0,6 mililitros.

Con una jeringa de 50 mililitros, con una aguja roma de calibre 19 de 1,5 pulgadas, cargue la solución en la celda IEF a través de los puertos de recolección de muestras. Luego, retire la celda del soporte y golpee la cámara del electrodo para desalojar y eliminar las burbujas.

Conecte la unidad al agua de refrigeración. Con la potencia suministrada a 15 vatios constantes, comience el fraccionamiento. Ejecute la unidad IEF hasta que el voltaje alcance un valor constante, aproximadamente tres horas.

Después de presionar el botón Harvest ON, alinee los pines del colector de fracciones con los puertos de recolección. Empuje los pasadores a través de la cinta de sellado para comenzar a recolectar las fracciones de Gymnema sylvestre.