Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida: una técnica de separación para el análisis de proteínas en mezclas complejas de proteínas basada en la carga y el peso molecular

Para la electroforesis en gel bidimensional de una mezcla de proteínas derivada de tejido tumoral homogeneizado, trátelo con tampón que contenga caótropos, detergente zwitteriónico y agente reductor. Los caótropos y el detergente desnaturalizan y solubilizan las proteínas. Los agentes reductores reducen los enlaces disulfuro de las proteínas, generando grupos tiol libres y desplegando las proteínas para una resolución óptima de las proteínas.

Transfiera la mezcla de proteínas tratada a un gradiente de pH inmovilizado, IPG, soporte de tiras. Coloque una tira de IPG que comprenda un gradiente de pH lineal dentro de la matriz de gel de acrilamida. Agregue aceite mineral para evitar la evaporación de la solución proteica. Transfiera el soporte a un sistema IEF de enfoque isoeléctrico. Deje que la solución de proteína rehidrate la tira.

Realizar IEF de primera dimensión. La corriente eléctrica hace que las proteínas cargadas migren a través del gradiente de pH hacia electrodos con carga opuesta, inmovilizándose en sus respectivos puntos isoeléctricos, pH en el que las proteínas tienen carga neta cero.

Después de la IEF, trate la tira de IPG con dodecil sulfato de sodio, SDS, un detergente aniónico que imparte carga negativa a las proteínas. Equilibre con un agente alquilante para modificar los grupos tiol de la proteína, asegurando la solubilidad de la proteína durante la electroforesis.

Cargue la tira en un gel resolutivo de poliacrilamida de poros pequeños prefabricado y asegúrelo con agarosa fundida. Llene las cámaras con tampón de electroforesis que contenga SDS. Iniciar electroforesis de segunda dimensión, perpendicular a IEF.

Las proteínas de mayor peso molecular cargadas negativamente se mueven lentamente a través del gel hacia el ánodo cargado positivamente que las proteínas más pequeñas, lo que facilita la separación basada en el tamaño.

Tiñe el gel. Las proteínas se pueden visualizar como puntos discretos en el gel.

Para comenzar este procedimiento, agregue 250 microlitros de una solución de muestra de proteína previamente preparada a cada ranura de un soporte de tira IPG de 13 centímetros. Coloque una tira de IPG de 18 centímetros, con el lado del gel hacia abajo, en cada solución de muestra de proteína, teniendo cuidado de evitar burbujas. Luego, agregue de 3 a 4 mililitros de aceite mineral para cubrir cada tira de IPG.

A continuación, ensamble cada soporte de tira IPG en un sistema de enfoque isoeléctrico, con el extremo puntiagudo en la placa posterior y el extremo cuadrado en la placa frontal. Después de rehidratar las tiras IPG durante 18 horas a temperatura ambiente, configure los parámetros IEF en el sistema de enfoque isoeléctrico con un tiempo de ejecución total de 7,5 horas y 36.875 voltios hora.

Después de IEF, saque cada tira IPG del sistema de enfoque isoeléctrico y elimine el exceso de aceite mineral con una toalla de papel insoluble. Luego, envuelva cada tira en una hoja de envoltura de plástico y guárdela a -80 grados centígrados.

Para fundir un gel PAGE al 12%, agregue agua doblemente destilada, tampón Tris-clorhídrico 1.5 molar, solución madre de acrilamida/bisacrilamida al 40%, persulfato de amonio al 10% y TEMED a un vaso de precipitados. Mezcle la solución de gel suavemente, teniendo cuidado de evitar burbujas.

Vierta suavemente la solución de gel en una cámara de fundición múltiple, hasta la altura de gel esperada de 19 centímetros. Inmediatamente, agregue aproximadamente 3 mililitros de agua doblemente destilada a la cámara de fundición múltiple para cubrir cada gel de resolución y deje que cada gel polimerice durante aproximadamente una hora.

Este paso es muy importante para preparar un gel SDS-PAGE de alta calidad. Se debe agregar inmediatamente un volumen igual de agua en la parte superior de cada gel.

Prepare dos litros de tampón de electroforesis, luego agregue el tampón a un tanque de amortiguación de la unidad de separación de electroforesis.

Después de sacar las tiras IPG enfocadas del congelador, colóquelas en un recipiente de plástico que contenga 1 mililitro de tampón de equilibrio reductor y un rastro de azul de bromofenol, y equilibre durante 10 minutos con un balanceo suave. Después de retirar el tampón de equilibrio reductor, agregue 4 mililitros de tampón de equilibrio de alquilación y un rastro de azul de bromofenol a las tiras de IPG, y equilibre durante 10 minutos con un balanceo suave.

Durante el equilibrio del gel, desmonte la cámara de fundición múltiple y retire el casete de gel de resolución preparado. Enjuague el casete de gel tres veces con agua doble destilada, luego, elimine el exceso de agua del casete de gel con una toalla de papel insoluble y colóquelo en un soporte de gel.

A continuación, enjuague las tiras equilibradas de IPG con tampón de electroforesis y elimine el exceso de líquido en la superficie de cada tira de IPG con una toalla de papel insoluble. Coloque una tira IPG sobre el gel SDS-PAGE de resolución, permitiendo que el lado de plástico de la tira IPG entre en contacto con la placa de vidrio más larga, con el extremo puntiagudo hacia la izquierda.

Ahora, agregue rápidamente de 3 a 4 mililitros de agarosa caliente al 1% y tampón de electroforesis SDS, para sellar la tira IPG en la parte superior de cada gel SDS-PAGE, y coloque la parte superior de la tira IPG hacia abajo en la parte superior de la placa de vidrio más corta, teniendo cuidado de evitar burbujas.

Estos pasos son muy importantes para sellar la tira IPG a un gel SDS-PAGE. Las soluciones de agarosa caliente deben agregarse inmediatamente y la tira de IPG debe colocarse inmediatamente en la parte superior del gel SDS.

Después de la polimerización, inserte el casete de gel ensamblado verticalmente entre las juntas de plástico y un sistema de electroforesis vertical. Coloque la parte superior del gel con la tira IPG al lado del cátodo. A continuación, ajuste el nivel de tampón de electroforesis para sumergir el casete de gel agregando el volumen apropiado de tampón al sistema de electroforesis.

Conecte y configure la fuente de alimentación en modo de voltaje constante y funcione a 200 voltios durante aproximadamente 370 minutos mientras monitorea el tinte. Una vez completada la ejecución, saque el casete de gel del sistema de electroforesis y retire suavemente el gel del casete de gel, teniendo cuidado de no rasgar el gel.