Electroforesis en gel de zimografía: una técnica electroforética para detectar metaloproteinasas de matriz mediante la evaluación de la actividad enzimática

La metaloproteinasa de matriz, o MMP, una proteasa multidominio que comprende propéptidos y dominios catalíticos, es secretada como una enzima inactiva o zimógeno por células específicas. La interacción entre el ion de zinc del dominio catalítico y el residuo de cisteína del dominio propeptídico mantiene la MMP inactiva.

Para detectar MMP en sobrenadante de cultivo celular mediante electroforesis en gel de zimografía, llene el tanque de electroforesis que contiene el casete de gel con dodecil sulfato de sodio o tampón de funcionamiento que contenga SDS.

Cargue el sobrenadante de cultivo mezclado con tampón de carga, seguido de patrones de proteínas, en pocillos de gel de poliacrilamida, copolimerizado con un sustrato proteico específico de MMP.

SDS, un detergente con carga negativa, en condiciones no reductoras, interrumpe las interacciones cisteína-zinc en MMP y desnaturaliza las proteínas al tiempo que imparte una carga negativa.

Realizar electroforesis. El campo eléctrico hace que las proteínas cargadas negativamente migren hacia el ánodo cargado positivamente, lo que provoca la separación de proteínas basada en el tamaño.

Después de la electroforesis, trate el gel con un tampón renaturalizante que contenga detergente no iónico. Los detergentes no iónicos reemplazan a SDS, renaturalizando las proteínas y restaurando parcialmente la actividad de MMP. Los MMP se procesan aún más a un estado completamente activo.

Incubar en un tampón en desarrollo que contenga cationes metálicos divalentes esenciales para la actividad de MMP. Las MMP activas, junto con los cationes, digieren el sustrato de MMP en el gel. Lave el gel para eliminar los productos digeridos. Tiñe el gel.

Las áreas de actividad de MMP, desprovistas de sustrato de MMP, aparecen como bandas claras sobre un fondo azul oscuro de sustrato no digerido. Usando el software adecuado, la intensidad de la banda de gel se puede correlacionar con la actividad de MMP.

Antes del inicio de este protocolo, prepare todas las metaloproteinasas de matriz, o MMP, adecuadamente para mantener la función de las enzimas. Las muestras se pueden usar inmediatamente o almacenar a -80 grados centígrados. Aquí se utiliza MMP-2, también conocida como gelatinasa A o colagenasa tipo IV, para demostrar la visualización de la actividad de MMP con zimografía.

Una vez preparadas las enzimas MMP, obtener una bolsa de gel de gelatina con zimograma al 10% que contenga un gel dentro de un casete. Enjuague el casete con agua desionizada. Retire la cinta protectora de la parte inferior del casete y el peine de la parte superior del gel. Enjuague los pocillos tres veces con tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS.

Coloque el gel en un aparato de electroforesis de minicelda, asegurándose de que el lado más pequeño del casete mire hacia adentro. Bloquee el gel en su lugar con la cuña de tensión de gel. Llene la cámara superior del aparato con un tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS por encima del nivel de los pocillos y verifique si hay fugas. Llene también la cámara inferior de la configuración de electroforesis en gel con tampón de funcionamiento.

Luego, cargue 10 microlitros de marcador molecular de proteína.

Mezcle una cantidad igual de la muestra con un tampón de carga de gel que no contenga agentes reductores. A diferencia de SDS-PAGE normal, no hierva las muestras y, en su lugar, cárguelas directamente en los pocillos del gel, utilizando puntas de carga de gel. Estos pocillos pueden contener hasta 20 microlitros de volumen.

Coloque la tapa en la minicelda y conecte los cables de los electrodos a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de alimentación y configure el gel para que funcione a 125 voltios, constante durante 90 minutos. Verifique la formación de pequeñas burbujas en el alambre de la cámara inferior, lo que indica la circulación de corriente.

Al ejecutar el primer gel, controle el progreso de la migración cada 15 minutos, utilizando el azul de bromofenol incluido en el tampón de carga como indicador. Para cada gel, prepare 100 mililitros de tampón renaturalizante de zimogramas 1X y 200 mililitros de tampón revelador de zimogramas, ambos en agua desionizada.

Cuando el tinte de seguimiento azul de bromofenol llegue al fondo del gel, apague la fuente de alimentación.

Abra la minicelda y retire el gel. Separe los dos lados del casete con un cuchillo de gel. Corta una esquina para marcar la dirección del gel. Retire con cuidado el gel del casete y colóquelo en un recipiente con 100 mililitros de tampón de renaturalización.

Incube el gel durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.

Retire el tampón renaturalizante y agregue 100 mililitros de tampón de revelado al gel. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.

Luego, retire el tampón de revelado y agregue 100 mililitros adicionales de tampón de revelado fresco al gel. Incube el gel durante la noche a 37 grados centígrados.

Después de la incubación durante la noche, retire el tampón de revelado y lave el gel incubándolo con agua desionizada, bajo agitación suave, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repita este lavado dos veces.

Coloque el gel en un protector de lámina de plástico y elimine las burbujas. Luego, escanee el gel con un escáner fotográfico para guardar la posición exacta de las bandas estándar de proteínas, ya que apenas serán visibles después de la tinción del gel.

Tiñe el gel agregando 20 mililitros de SimplyBlue SafeStain al gel. Incube el gel durante 1 hora a temperatura ambiente, bajo agitación suave.

Retire el SimplyBlue SafeStain y retenga el gel en 100 mililitros de agua desionizada a temperatura ambiente bajo agitación suave.

Después de 1 hora, reemplácelo con agua desionizada fresca y continúe incubando el gel durante al menos una hora.