Name: A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Aprenda a evaluar la actividad vascular de células tumorales mediante un ensayo de formación de tubos en Matrigel. Este método permite cuantificar la capacidad angiogénica in vitro para modelos de xenoinjerto.

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Este trabajo fue financiado por el NCI R01 CA120659 (RS).

1. A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica <ol><li> Preparación de las células tumorales y las células endoteliales microvasculares: las células de tumores cerebrales, tales como U87 células, las células del melanoma B16F1, el cáncer de mama MDA-MB-435, y las células del colon HCT116 fueron cultivadas en DMEM suplementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina (todos de Invitrogen ). Línea de células endoteliales humanas células endoteliales microvasculares (HMVECs) se cultivaron en medio EBM2 (Lonza), complementado con 1 mg / ml de hidrocortisona y 1 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico, el 10% de SFB y penicilina / estreptomicina. Las células fueron lavadas tres veces con PBS y distante con el 0,05% de tripsina / EDTA (Invitrogen). Después de la centrifugación a 2.000 rpm durante 5 min, gránulos de las células se lavaron de nuevo con PBS. Luego, las células sedimentadas se contó con un hemocitómetro. </li><li> Preparación Matrigel: una alícuota de factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Bioscience) se calentó a temperatura ambiente. Antes de que se están descongelando, fue trasladado en hielo y el líquido se mantuvo en hielo durante al menos 10 min. De 50 l de Matrigel se sembró a 96 y placas a un nivel horizontal que permite que el Matrigel para distribuir uniformemente, y se incubó durante 30 min a 37 ° C. </li><li> La formación del tubo: las células (1-2 x 10 4) se volvió a suspender con suero libre de DMEM para las células tumorales o EBM-2 para las células endoteliales, y se carga en la parte superior de la Matrigel. Si este ensayo se utilizó para medir los efectos de algunos agentes en el desarrollo de los túbulos, estos agentes (estimuladores o inhibidores) se añadieron al medio libre de suero. Cada grupo condicional contenida 4-6 pozos. </li><li> Imagen y análisis de datos: Después de la incubación a 37 ° C durante la noche, cada uno así se analizan directamente bajo un microscopio. Si los túbulos se necesitaban para la fijación, 100 l de formalina salina al 10% basado en solución se añadió con suavidad y diez minutos más tarde, estaba listo para su análisis. Bajo un microscopio con contraste de fase 10x, los túbulos en cada campo fueron fotografiadas y un promedio de túbulos 3-5 campos al azar en cada pozo se había contado. </li></ol> 2. Los resultados representativos: HMVECs se utilizaron como control positivo, ya que estos tubos se desarrollaron a partir clara cuerpos celulares alargados que conectan a la red de forma poligonal. Células B16F1, U87, y MDA-MB-435 desarrollado túbulos vasculares similares a las formadas por HMVECs, pero HCT116 células no (Figura 1). Una célula dependiente de la dosis la formación del tubo se ha probado en células U87. Como se demuestra en la figura 2, 10000 células formadas túbulos interrumpido. Una vez que las células se duplicó, de una red vascular sólido es comparable a los observados en HMVECs. En contraste, las células de menos de 5.000 no lograron formar un fenotipo vascular. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Formación del tubo inducida por HMVECs, U87, MDA-MB-435, y las células B16F1, pero no las células HCT116. Todas las células (2 x 10 4) fueron cargados en Matrigel y se incubaron durante la noche. Túbulos estaban utilizando imágenes de contraste de fase. HMVECs se utilizaron como control positivo. Un representante de 3-5 campos se muestran. Bar: 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. U87 celular inducida por los túbulos, en un número de celular dependiente de forma. Diferentes números de células U87 como se indica en las esquinas se utilizan para la formación del tubo. HMVECs fueron utilizados para un control positivo. Bar: 100 mm.

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<li>Ribeiro, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostatic+properties+of+the+SV-40+transfected+human+microvascular+endothelial+cell+line+%28HMEC-1%29.+A+representative+in+vitro+model+for+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium.</a> Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).</li>
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<li>Folberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+plasticity+in+uveal+melanoma%3A+microenvironment+directed+dampening+of+the+invasive+and+metastatic+genotype+and+phenotype+accompanies+the+generation+of+vasculogenic+mimicry+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.</a> American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+membrane+antigen+directed+selective+thrombotic+infarction+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors.</a> Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma%3A+implications+for+anti-vasculogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li>
<li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li>
<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

A fin de que este ensayo tenga éxito, la calidad de Matrigel debe ser probado por primera vez. Una pequeña muestra se puede obtener de BD Bioscience de pre-ejecución del ensayo utilizando HMVECs. Diferentes productos por lotes puede mostrar cualidades diferentes en los que algunos lotes no ofrecen condiciones óptimas para la formación del tubo. En segundo lugar, las burbujas deben ser evitados cuando una parte alícuota de Matrigel se carga en placas de 96 pozos, porque las burbujas pueden alterar la formación de túbulos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> El factor de crecimiento reducido Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TS100 microscopio </td><td> Nikon </td><td></td></tr></tbody></table>

a matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Durante las últimas décadas, un ensayo de la formación del tubo con el factor de crecimiento reducido Matrigel ha sido generalmente empleado para demostrar la actividad angiogénica de las células endoteliales vasculares in vitro 1-5. Sin embargo, evidencia reciente ha demostrado cada vez que este ensayo no se limita a probar el comportamiento de las células endoteliales vasculares. Por el contrario, también se ha utilizado para poner a prueba la capacidad de un número de células tumorales a desarrollar un fenotipo vascular 6-8. Esta capacidad fue consistente con su comportamiento vasculogénica identificado en animales xenotransplantado, un proceso conocido como vasculogénica mímica (VM) 9. Hay una gran cantidad de evidencias que demuestran que las células tumorales mediada por VM juega un papel vital en el desarrollo del tumor, con independencia de la angiogénesis de las células endoteliales 6, 10-13. Por ejemplo, las células tumorales se encuentran para participar en la sangre perfunde la formación, el canal vascular en muestras de tejido de pacientes con melanoma y glioblastoma 8, 10, 11. En este sentido, este ensayo se describe la red tubular como una herramienta útil en la evaluación de la actividad vasculogénica de las células tumorales. Hemos encontrado que algunas líneas celulares tumorales como el melanoma B16F1 células, las células de glioblastoma U87, y el cáncer de mama MDA-MB-435 células son capaces de formar túbulos vasculares, pero algunos no lo hacen, como el cáncer de colon HCT116 células. Además, este fenotipo vascular depende de el número de células chapada en el Matrigel. Por lo tanto, este ensayo puede servir de gran utilidad para detectar el potencial vascular de una variedad de tipos de células incluyendo las células vasculares, las células tumorales, así como otras células.

Un ensayo de la formación del tubo se utiliza para evaluar la actividad vascular de las células tumorales.

A Matrigel basado en tubo de ensayo de formación para evaluar la actividad de las células tumorales vasculogénica

Durante las últimas décadas, se ha empleado habitualmente un ensayo de formación de tubos utilizando Matrigel con reducción de factores de crecimiento para demostrar la angiogénica...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la formación de tubos por diversos tipos de células tumorales in vitro como una manera de evaluar la actividad vascular in vivo. Esto se logra añadiendo células tumorales sobre matrigel para inducir la formación de tubos. Como segundo paso.Las células sobre matri gel se incuban durante la noche a 37 grados Celsius, lo que permite que se produzca la formación de tubos. A continuación, se obtienen imágenes de los tubos generados por cada tipo celular. Con el fin de cuantificar el número promedio de tubos formados por cada tipo celular, se obtienen resultados que muestran la capacidad potencial de estas células para formar vasculatura in vivo basados en modelos de tumores xenoinjertados.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como cómo medir la actividad vascular in vitro. Para preparar las células tumorales, comience por cultivar melanoma UAD siete, B 16 F1 MDA, MB 4 35 o células de colon HCT uno 16 en DMEM suplementado con 10%FPS y penicilina. Células endoteliales microvasculares humanas o H ECS en medio EBM dos suplementado con un microgramo por mililitro de hidrocortisona, un nanogramo por mililitro de factor de crecimiento epidérmico, 10%FBS y penicilina.Lave las células con PBS usando estreptomicina, luego desprenda con tripsina-EDTA al 0,05 %, centrifugue las células a 2000 RRP M durante cinco minutos. A continuación, vuelva a lavarlas con PBS. Cuente las células utilizando un hemocitómetro para preparar el gel de matrigel tibio.Una alícuota de un mililitro de Matrigel con factor de crecimiento reducido se llevó a temperatura ambiente. A continuación, colóquela inmediatamente en hielo durante 10 minutos. Pipetee 50 microlitros en los pocillos de una placa de 96 pocillos.Y incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos, resuspender una a dos veces 10 a la quinta células tumorales o endoteliales en DMEM o e BM2, respectivamente, y sembrarlas en la parte superior del matrigel. Si se estudian los efectos de reactivos sobre el desarrollo de túbulos, añadir el reactivo al medio sin suero e incubar durante la noche a 37 grados Celsius. Para el análisis de imágenes, añadir 10 microlitros de una solución al 10% de formal en salino durante 10 minutos.Luego, realice la imagen con un microscopio de contraste de fases bajo un objetivo de 10 x. Cuente el número de túbulos en tres a cinco campos aleatorios de cada uno. A continuación, calcule un promedio aquí.Los HMC se utilizaron como control positivo, ya que estos túbulos se desarrollaron a partir de cuerpos celulares alargados y definidos que se conectaron para formar una red poligonal. Las células B16F1, U87 y MDA-MB-435 desarrollaron túbulos vasculares similares a los formados por las HEC. Sin embargo, las células HCT116 no lo hicieron.Se evaluó la formación de tubos dependiente de la dosis celular en células U 87. Como se muestra en esta figura, 10.000 células formaron tubos discontinuos una vez que las células se duplicaron. Se observó una red vascular sólida comparable a la vista en H ecs.En contraste, la inóculación con menos de 5.000 células no logró formar un fenotipo vascular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar con éxito un experimento de ensayo de formación de tubos en matrigel para medir la formación de tubos por células cancerosas in vitro.

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Investigación

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Biología

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