Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Las bacterias producen segundos mensajeros de nucleótidos, NSM (moléculas de señalización intracelular), en respuesta a estímulos apropiados. Estas moléculas se unen a las proteínas diana y regulan las funciones bacterianas.

Para identificar estas proteínas diana utilizando la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando, tome una placa de pocillos múltiples con lisado de células bacterianas que contenga proteínas solubles. Estas proteínas se derivan de diferentes clones bacterianos que expresan ORF individuales (marcos de lectura abiertos) en el genoma, lo que garantiza que cada pocillo tenga una proteína distinta.

Agregue una mezcla de guanosina tetra y pentafosfatos, NSM marcados con fósforo radiactivo. Estas moléculas se unen a las proteínas diana en el lisado. Con una herramienta de alfiler, recolecte una cantidad igual de líquido de cada pocillo. Coloque la herramienta sobre una membrana de nitrocelulosa para depositar el líquido en forma de manchas.

Las proteínas diana se unen a la membrana a través de interacciones no covalentes que impiden su difusión. Esto secuestra los NSM radiomarcados unidos en el punto central de aplicación. Los NSM libres se difunden radialmente con la fase líquida a través de la acción capilar.

Utilice imágenes de fósforo para detectar las señales radiactivas y obtener una imagen digital de las manchas. Defina las manchas usando dos círculos. El exterior representa la periferia de los NSM difusos. El círculo interior representa los NSM secuestrados.

Calcule la fracción de unión: la intensidad de la radiactividad detectada desde el círculo interior sobre la radiactividad total del punto difuso. Localice puntos con altas fracciones de unión para identificar los pocillos con proteínas diana unidas a NSM.

Para el cribado DRaCALA de las proteínas diana, agregue 20 microlitros de los lisados de células enteras descongelados a pocillos individuales de una placa de microtitulación de fondo en V de 96 pocillos y agregue 2,5 unidades de endonucleasa Serratia marcescens a cada pocillo. Después de 15 minutos a 37 grados centígrados, coloque los lisados en hielo durante 20 minutos.

A continuación, mezcle volúmenes iguales de pentafosfato de guanosina marcado con fósforo 32 y tetrafosfato de guanosina, y agregue 1x tampón de lisis # 1 a la mezcla para obtener una solución de pentafosfato de guanosina de cuatro nanomolares.

Con una pipeta multicanal y puntas de pipeta filtradas, mezcle 10 microlitros de la mezcla de pentafosfato de guanosina con el lisado celular para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, lave una herramienta de pasador 96X tres veces en una solución al 0,01% de detergente no iónico durante 30 segundos, seguido de 30 segundos de secado en una toalla de papel por lavado, antes de colocar la herramienta de pasador en la placa de muestra de 96 pocillos. Después de 30 segundos, levante la herramienta de alfileres hacia arriba y colóquela hacia abajo sobre una membrana de nitrocelulosa durante 30 segundos.

Después de cinco minutos de secado, coloque la membrana de nitrocelulosa en la carpeta de plástico transparente para la exposición a la pantalla de fósforo de almacenamiento y la visualización mediante imágenes de fósforo, como se demuestra.

Para cuantificar e identificar posibles proteínas diana en el software de análisis asociado con el generador de imágenes de fósforo, abra el archivo .gel de las placas visualizadas.

Para definir los puntos a analizar, utilice la función "Análisis de matrices" para configurar una cuadrícula de 12 columnas por 8 filas. Para circunscribir el borde exterior de todas las manchas, defina círculos grandes. Exporte el "Volumen + Fondo" y el "Área" de los círculos grandes definidos a una hoja de cálculo, para circunscribir los pequeños puntos internos. Reduzca el tamaño de los círculos definidos.

Exporte el "Volumn+Fondo" y el "Área" de los círculos pequeños definidos y guarde todos los datos en la hoja de cálculo. Coloque los círculos para que se superpongan con los puntos según sea necesario, cambiando el tamaño a un poco más grande que los puntos reales.

Utilice la ecuación para calcular las fracciones vinculantes en la hoja de cálculo y trace los datos. Luego, identifique las posibles proteínas de unión en los pocillos que muestran altas fracciones de unión en comparación con la mayoría de los otros pocillos.