Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

Las bacterias producen segundos mensajeros de nucleótidos, NSM (moléculas de señalización intracelular), en respuesta a estímulos apropiados. Estas moléculas se unen a las proteínas diana y regulan las funciones bacterianas.

Para identificar estas proteínas diana utilizando la acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando, tome una placa de pocillos múltiples con lisado de células bacterianas que contenga proteínas solubles. Estas proteínas se derivan de diferentes clones bacterianos que expresan ORF individuales (marcos de lectura abiertos) en el genoma, lo que garantiza que cada pocillo tenga una proteína distinta.

Agregue una mezcla de guanosina tetra y pentafosfatos, NSM marcados con fósforo radiactivo. Estas moléculas se unen a las proteínas diana en el lisado. Con una herramienta de alfiler, recolecte una cantidad igual de líquido de cada pocillo. Coloque la herramienta sobre una membrana de nitrocelulosa para depositar el líquido en forma de manchas.

Las proteínas diana se unen a la membrana a través de interacciones no covalentes que impiden su difusión. Esto secuestra los NSM radiomarcados unidos en el punto central de aplicación. Los NSM libres se difunden radia