Ensayo de transferencia de puntos para cuantificar el genoma viral

Para cuantificar el ADN viral mediante el ensayo de transferencia de puntos, comience con una suspensión de ADN viral aislada. Tratar con una solución alcalina para desnaturalizar el ADN bicatenario en hebras simples para su posterior hibridación.

Ensamble el aparato de transferencia de puntos con una membrana de nailon prehumedecida. Cargue ADN viral desnaturalizado y soluciones de ADN plasmídico estándar linealizadas en los pocillos. Aplique un vacío adecuado, facilitando la transferencia efectiva de ADN monocatenario viral cargado negativamente y la unión a la superficie de la membrana cargada positivamente a través de interacciones electrostáticas, formando patrones de puntos.

Después de la ejecución, lave la membrana con tampón de citrato de sodio, lo que ayuda a mejorar la sensibilidad del ensayo. Después del secado, exponga la membrana a la luz ultravioleta, reticulando el ADN manchado a la membrana.

Agregue un fragmento de ADN no heterólogo desnaturalizado por calor y una suspensión de sonda de ADN marcada con fósforo radiactivo específico del genoma viral en el tampón de hibridación a la membrana. Incubar, facilitando la hibridación.

Los fragmentos de ADN actúan como agentes bloqueantes, uniéndose a las regiones restantes de la membrana, minimizando la unión inespecífica de la sonda. La sonda radiactiva se hibrida con la secuencia complementaria en el ADN monocatenario viral.

Lave con tampón de lavado para eliminar las sondas no hibridadas. Utilizando el sistema de escaneo de imágenes de fósforo, cuantificar las señales radiactivas emitidas por las sondas radiactivas hibridadas con el genoma viral en la membrana, para obtener señales de transferencia de puntos.

A partir de la curva estándar, la intensidad de la señal de cada punto en la membrana se puede usar para calcular la cantidad de ADN viral en la muestra.

Para llevar a cabo el ensayo de transferencia de puntos, prepare estándares de ADN plasmídico diluyendo el ADN plasmídico del genoma del vector AAV a 10 nanogramos por microlitro en agua o tampón Tris-HCl. Transfiera una alícuota de 25 microlitros del ADN plasmídico diluido a un tubo nuevo y linealícelo con una enzima de restricción apropiada en un volumen de reacción de 50 microlitros durante una hora.

Agregue 450 microlitros de agua o TE al tubo que contiene el estándar de ADN plasmídico digerido y mezcle bien. Luego, transfiera 70 microlitros de esta mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros con 1,330 microlitros de agua o TE para hacer un estándar de plásmido diluido.

Para configurar el aparato de transferencia de puntos, con unas tijeras, corte la membrana secante a un tamaño apropiado para la cantidad de muestras y estándares. Remoje la membrana con agua durante 10 minutos, antes de colocarla en el aparato de transferencia de puntos. Luego, cubra los pozos no utilizados. Agregue agua a los pozos en los que se cargarán las muestras. Aplique una aspiradora, extraiga el agua a través de los pozos, verifique si hay errores y luego vuelva a apretar los tornillos. Vuelva a realizar la prueba si es necesario.

Aplique 400 microlitros de cada estándar de ADN plasmídico diluido a cada pocillo y ejecute cuatro carriles de diluciones estándar. Use dos alícuotas separadas del resumen estándar y cargue cada una por duplicado. Luego, aplique 200 microlitros por pocillo de cada muestra de ADN viral. Aplique una aspiradora suave para acumular las soluciones de ADN a través de los pocillos. Luego, una vez que todos los pozos se hayan vaciado, libere el vacío ajustando la válvula de tres vías.

Agregue 400 microlitros de solución alcalina 1X a cada pocillo. Luego, espere cinco minutos antes de volver a aplicar el vacío para vaciar los pocillos. Vuelva a aplicar el vacío y desmonte el aparato de transferencia de puntos. Luego, retire la membrana y enjuáguela con 2X SSC.

Coloque la membrana sobre una toalla de papel limpia, con el lado unido al ADN hacia arriba, para eliminar el exceso de tampón. Use un reticulante UV apropiado para reticular UV el ADN manchado a la membrana. La membrana ahora está lista para la hibridación.

Coloque la membrana en una botella de hibridación con el lado unido al ADN hacia arriba. Enjuague la membrana con 5 a 10 mililitros de tampón de hibridación precalentado y deseche el tampón. Luego, agregue 10 mililitros de tampón de hibridación precalentado y coloque la botella en un horno de hibridación giratorio a 65 grados centígrados. Gire la botella durante al menos cinco minutos.

Agregue rápidamente el ADN de esperma desnaturalizado y la sonda radiactiva al tampón de hibridación en la botella y agítelo durante 10 segundos para mezclar. Regrese la botella al horno a 65 grados centígrados e incube con rotación a 65 grados centígrados durante al menos cuatro horas.

Una vez que se completa la hibridación, detenga la rotación, retire la botella de hibridación y luego vierta la solución de sonda radiactiva en un tubo cónico de 50 mililitros con una tapa de sellado a prueba de fugas. Para lavar la membrana, agregue de 20 a 30 microlitros de tampón de lavado precalentado a la botella de hibridación y gírela durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.

Después del tercer lavado, retire la membrana de la botella de hibridación y, con toallas de papel, retire el exceso de tampón de la membrana. Luego, coloque la membrana en un soporte de papel de plástico transparente. Con un contador Geiger, verifique las señales radiactivas en la membrana.

[TRANALES]

Después de exponer la pantalla de imágenes de fósforo borrada a la membrana, escanee la pantalla con un sistema de escaneo de imágenes de fósforo y obtenga los datos sobre la intensidad de la señal de cada punto.