Ensayo de transferencia de puntos para cuantificar el genoma viral

Para cuantificar el ADN viral mediante el ensayo de transferencia de puntos, comience con una suspensión de ADN viral aislada. Tratar con una solución alcalina para desnaturalizar el ADN bicatenario en hebras simples para su posterior hibridación.

Ensamble el aparato de transferencia de puntos con una membrana de nailon prehumedecida. Cargue ADN viral desnaturalizado y soluciones de ADN plasmídico estándar linealizadas en los pocillos. Aplique un vacío adecuado, facilitando la transferencia efectiva de ADN monocatenario viral cargado negativamente y la unión a la superficie de la membrana cargada positivamente a través de interacciones electrostáticas, formando patrones de puntos.

Después de la ejecución, lave la membrana con tampón de citrato de sodio, lo que ayuda a mejorar la sensibilidad del ensayo. Después del secado, exponga la membrana a la luz ultravioleta, reticulando el ADN manchado a la membrana.

Agregue un fragmento de ADN no heterólogo desnaturalizado por calor y una suspensión de sonda de ADN marcada con fósforo radiactivo específico del genoma viral en el tampón de hibridación a la membrana. Incubar, facilitando la hibridación.

Los fragmentos de ADN actúan como agent