Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

CD95, un receptor de muerte, se une a sus anticuerpos agonistas, desencadenando el ensamblaje de un complejo de señalización inductor de muerte, o DISC, un complejo multiproteico que recluta procaspasa 8. En el DISC, la procaspasa 8 se dimeriza y procesa para formar varios productos intermedios de escisión y, finalmente, una forma activa que inicia la apoptosis.

Para analizar el procesamiento de caspasa-ocho mediante transferencia occidental quimioluminiscente, tome un lisado que contenga productos intermedios de escisión asociados a DISC de caspasa 8 en un tubo. Complemente esto con anticuerpos anti-CD95 capturados con perlas de proteína A-agarosa. Los anticuerpos anti-CD95 se unen al componente DISC, CD95, formando complejos proteicos.

Cargue la muestra en un gel de poliacrilamida SDS para separar los intermedios de caspasa 8 inmunoprecipitados de diferentes tamaños como bandas distintas. Coloque el gel sobre una membrana secante y aplique una corriente eléctrica. Los intermedios de caspasa 8 salen del gel hacia la membrana secante.

Trate la membrana con una solución bloqueadora que contenga proteínas para saturar los sitios de unión a proteínas, evitando uniones no específicas.