Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

CD95, un receptor de muerte, se une a sus anticuerpos agonistas, desencadenando el ensamblaje de un complejo de señalización inductor de muerte, o DISC, un complejo multiproteico que recluta procaspasa 8. En el DISC, la procaspasa 8 se dimeriza y procesa para formar varios productos intermedios de escisión y, finalmente, una forma activa que inicia la apoptosis.

Para analizar el procesamiento de caspasa-ocho mediante transferencia occidental quimioluminiscente, tome un lisado que contenga productos intermedios de escisión asociados a DISC de caspasa 8 en un tubo. Complemente esto con anticuerpos anti-CD95 capturados con perlas de proteína A-agarosa. Los anticuerpos anti-CD95 se unen al componente DISC, CD95, formando complejos proteicos.

Cargue la muestra en un gel de poliacrilamida SDS para separar los intermedios de caspasa 8 inmunoprecipitados de diferentes tamaños como bandas distintas. Coloque el gel sobre una membrana secante y aplique una corriente eléctrica. Los intermedios de caspasa 8 salen del gel hacia la membrana secante.

Trate la membrana con una solución bloqueadora que contenga proteínas para saturar los sitios de unión a proteínas, evitando uniones no específicas.

Agregue una solución de anticuerpos primarios, que se unen a los productos de caspasa-ocho en un sitio específico.

Agregue anticuerpos secundarios marcados con enzimas que se unan específicamente a la región Fc complementaria del anticuerpo primario para formar un complejo producto de escisión de caspasa-ocho-anticuerpo primario-anticuerpo secundario.

Agregue un sustrato quimioluminiscente que reaccione con la enzima conjugada con anticuerpos secundarios y emita luz. La intensidad de la luz emitida se correlaciona con la cantidad de producto de escisión de caspasa-ocho.

Para realizar el western blot, agregue 20 microlitros de tampón de carga 4X a las perlas y caliente a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Simultáneamente, caliente los controles de lisado a 95 grados centígrados durante 5 minutos. Cargue los lisados, los inmunoprecipitantes y un estándar de proteína en un gel SDS al 12,5% y funcione con un voltaje constante de 80 voltios.

Una vez finalizado el funcionamiento del gel, transfiera las proteínas del gel SDS a una membrana de nitrocelulosa. Una vez completada la transferencia, coloque la membrana seca en una caja e incube durante una hora en una solución de bloqueo, bajo agitación suave. Luego, lave la membrana tres veces durante 5 minutos con PBST.

Para detectar las proteínas, agregue el primer anticuerpo primario en la dilución indicada a la membrana e incube durante la noche a 4 grados centígrados con agitación suave. Al día siguiente, lave la membrana con tres lavados PBST de 5 minutos, luego, incube la membrana con 20 mililitros de anticuerpo secundario con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.

Lave la membrana tres veces con PBST nuevamente. Después de desechar el último lavado PBST, agregue aproximadamente 1 mililitro de sustrato de peróxido de rábano picante a la membrana y detecte la señal quimioluminiscente.