Sonda de péptido biotinilado que penetra en las células para detectar interacciones proteína-proteína

En las células, las proteínas se unen a sus proteínas que interactúan a través de secuencias específicas en su estructura, modulando el funcionamiento de las proteínas intracelulares.

Para detectar interacciones de proteínas intracelulares, tome un cultivo celular adherente. Aspira el medio.

Agregue un péptido biotinilado que penetre en las células, una solución BCPP e incube.

Cada BCPP contiene una secuencia peptídica que ayuda en la unión específica a la proteína intracelular objetivo. El péptido tiene un péptido que penetra en las células, CPP, en el extremo N del péptido y biotina en el extremo C para una fácil detección.

Durante la incubación, la región CPP cargada positivamente facilita la entrada del péptido unido a través de la membrana de la célula, llegando al citoplasma. El péptido se une a su socio proteico de interacción intracelular, formando un complejo de proteínas diana BCPP.

Agregue un tampón que contenga moléculas de detergente que rompan la membrana de la célula y liberen complejos de proteínas diana BCPP y otros componentes celulares.

Agregue una solución de avidina unida a perlas de agarosa, una glicoproteína que se une específicamente a la biotina en los BCPP. Incubar, permitiendo la unión irreversible de la avidina a la biotina y purificando los complejos de proteínas diana avidina-BCPP.

Centrífuga para granular las perlas. Vuelva a suspender las perlas en un tampón para escindir enlaces no covalentes entre las proteínas y eluir los complejos CPP-péptido-proteína de las perlas de biotina-avidina.

Analizar los complejos CPP-péptido-proteína mediante western blotting. Una banda de peso molecular más alta para el complejo CPP-péptido-proteína que los componentes del complejo indica una interacción exitosa entre los socios proteicos que interactúan.

Agregue el volumen de la solución madre de BCPP a los cultivos celulares para alcanzar la concentración que ha demostrado ser efectiva.

Por lo tanto, agregue 92,8 microlitros de 2 miligramos por mililitro de TAT-Connexin-43_{266-283-Biotina} por mililitro de medio de cultivo. Coloque las células en la incubadora a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5% durante 30 minutos, para asegurarse de que se produzcan las interacciones entre el BCPP y sus socios intracelulares.

Para realizar la extracción de proteínas, primero, aspire completamente el medio de cultivo. Luego, lave las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helada por cada 150 centímetros, con mucho cuidado para evitar el desprendimiento celular.

Para obtener el lisado celular, agregue 3 mililitros de tampón de lisis por matraz de 150 centímetros cuadrados y raspe bien la superficie con un raspador celular. Inclinar el matraz a unos 45 grados facilitará la recolección de los lisados celulares en sus tubos correspondientes.

Vierta 1 mililitro del lisado celular por tubo en 3 tubos de 1,5 mililitros marcados por condición. Para el pull-down, centrifugar los tubos de 1,5 mililitros a 11.000 x g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.

Transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos etiquetados como A. Transfiera una alícuota del sobrenadante por condición a diferentes tubos etiquetados como B. Luego, agregue 16,6 microlitros de tampón 4x Laemmli por 50 microlitros de lisado y congele a menos 20 grados centígrados. A continuación, homogeneizar muy bien la agarosa NeutrAvidin agitando suavemente.

Corta las puntas de las puntas de las pipetas para aumentar su diámetro y mejorar el pipeteo de las perlas. Luego, agregue 50 microlitros de agarosa NeutrAvidina por mililitro de lisado celular en los tubos A. Incube los lisados celulares a 4 grados Celsius durante la noche con agitación muy suave para permitir que NeutrAvidin interactúe con los BCPP unidos a sus socios intracelulares.

A continuación, centrifugar a 3.000 veces g durante 1 minuto a 4% grados centígrados para recoger el complejo de NeutrAvidina con proteínas. Retire con cuidado los sobrenadantes y transfiéralos a tubos limpios etiquetados como C. Guárdelos para usarlos en caso de que el pull-down no tenga éxito.

Para lavar el complejo de NeutrAvidin con proteínas, agregue tampón de lisis fresco a los gránulos de tubos A. Vuelva a suspender el pellet por inversión y repita la centrifugación. Repita este lavado cinco veces más. Todos estos sobrenadantes se pueden descartar.

A continuación, agregue 40 microlitros de tampón Laemmli 2x por tubo de 1,5 mililitros para gránulos obtenidos de matraces de 150 centímetros cuadrados de células confluentes. Luego, eluya a 100 grados centígrados durante 5 minutos para disociar las interacciones entre las proteínas.

Después de la elución, centrifugar durante 30 segundos a 8.200 veces g para granular las perlas de NeutrAvidina. Transfiera los sobrenadantes que contienen las proteínas disociadas con puntas capilares a nuevos tubos etiquetados como D.

Estos sobrenadantes ahora están listos para cargarse en un Western blot como se describe en el protocolo de texto, o se pueden congelar a menos 20 grados Celsius.