Espectroscopía de fluctuación de fluorescencia para estudiar la homooligomerización de proteínas

La espectroscopia de fluctuación de fluorescencia puede determinar el estado de oligomerización de las proteínas en una muestra.

Para comenzar, tome un portaobjetos con cámara que contenga una solución de monómero de proteína marcada con fluorescencia. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio confocal. Enfoque el rayo láser en una pequeña parte de la muestra, el volumen confocal, para excitar los monómeros de proteínas.

Las moléculas de proteína se difunden dentro y fuera del volumen confocal debido al movimiento browniano. Este movimiento provoca cambios rápidos en la intensidad de la fluorescencia, lo que lleva a fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo.

Agregue el agente dimerizante, un ligando bivalente que ayuda a que dos monómeros de proteínas se unan y, por lo tanto, formen un dímero. Debido a la dimerización, dos etiquetas fluorescentes se unen para formar una sola partícula, lo que aumenta la intensidad de fluorescencia por partícula: el brillo molecular.

El aumento del brillo molecular debido a la dimerización aumenta la amplitud de las fluctuaciones de fluorescencia, ya que dos etiquetas fluorescentes entran y salen juntas del volumen confocal.

Obtenga imágenes del volumen confocal a lo largo del tiempo antes y después de agregar el agente dimerizante.

Calcule el brillo de los píxeles individuales en las imágenes confocales y obtenga la curva de brillo medio a lo largo del tiempo.

La adición del agente dimerizante da como resultado un aumento del doble en el brillo debido a las señales de fluorescencia dual de cada partícula, mientras que el número total de moléculas de proteína sigue siendo el mismo, lo que indica la formación de dímeros.

Para configurar la matriz de placas multipocillos, primero, prepare una solución de FKBP12 purificado 100 nanomolares en el mismo tampón utilizado para la cromatografía de exclusión por tamaño. Sonicar y centrifugar con un centrifugado rápido de 13.000 RPM para evitar la formación de áridos.

Ahora, pipetee de 100 a 200 microlitros de la proteína diluida en una cámara de observación de 8 pocillos con fondo de vidrio. Agregue el dimerizador BB a concentraciones finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 y 500 nanomolares. Como referencia, prepare una solución de 100 mVenus nanomolares solo para evaluar los posibles efectos de agregación y precipitación, y para recuperar un valor de brillo para el monómero con la misma configuración de adquisición.

Se puede utilizar cualquier sistema confocal de microscopio de barrido óptico equipado con detectores digitales o detectores analógicos bien caracterizados, y capaz de mantener un tiempo de permanencia constante para cada píxel adquirido. Seleccione el objetivo de inmersión en agua de corrección de collar diseñado para espectroscopia de correlación de fluorescencia.

Ahora agregue una gota de agua al objetivo de inmersión en agua de corrección del collar. Monte la cámara de observación de 8 pocillos en el escenario. Establezca la trayectoria del haz de excitación encendiendo el láser de 514 nanómetros y configurándolo a una potencia de 20 a 100 nanovatios a la salida del objetivo. Encienda un detector HyD. Son preferibles los detectores capaces de contar fotones. Seleccione la ventana de emisión de 520 a 560 nanómetros.

Para el modo de adquisición, use 16 por 16 píxeles.

Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de modo que el tiempo de fotogramas sea más largo que la difusión de proteínas y el tiempo de permanencia de píxeles sea mucho más corto. Esto correspondió a establecer el tiempo de permanencia en aproximadamente 13 microsegundos para el sistema utilizado en esta demostración.

Coloque el orificio en una unidad Airy para la emisión correspondiente de aproximadamente 545 nanómetros. Seleccione el modo de adquisición de tiempo xy y seleccione el número de fotogramas que se adquirirán por adquisición y pozo. Ahora, establezca el tamaño de píxel en aproximadamente 120 nanómetros.

Si el sistema está equipado con un modo de alto rendimiento, introduzca las coordenadas de cada pozo y el número de adquisiciones por pozo para automatizar el proceso. Si el sistema está equipado con un sistema de perfusión, cargue la solución BB y programe la perfusión para que comience justo después del cuadro número 5,000 para evaluar la cinética de dimerización mientras adquiere 10,000 imágenes.

Seleccione el pozo correcto y concéntrese en la solución. Luego, inicie la adquisición y guarde la pila de imágenes resultante en formato TIFF.