Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Para detectar interacciones entre complejos de proteínas heteroméricas que involucran múltiples proteínas con ADN diana utilizando el ensayo híbrido de levadura modificado, tome una placa de múltiples pocillos que contenga la concentración deseada de un cultivo de células de levadura transformado y en crecimiento activo.

Estas células contienen una secuencia de ADN específica aguas arriba del gen indicador que codifica β-galactosidasa, impulsada por el promotor GAL-4, mientras que carecen de la proteína endógena del factor de transcripción GAL-4. Las células expresan una proteína diana fusionada con el dominio de activación GAL-4 y otra proteína que carece del dominio de unión al ADN GAL-4.

Si estas proteínas interactúan, podrían formar un complejo, lo que permitiría que la proteína diana se una a la secuencia de ADN aguas arriba en la región promotora del gen reportero. El dominio de activación de GAL-4 activa la expresión de la enzima β-galactosidasa reportera.

centrífuga. Vuelva a suspender las celdas en un tampón adecuado. Congele y descongele las células para lisarlas y liberar β-galactosidasa. Agregue beta-mercaptoetanol y un tampón que contenga sustrato de β-galactosidasa.

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