Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Para detectar interacciones entre complejos de proteínas heteroméricas que involucran múltiples proteínas con ADN diana utilizando el ensayo híbrido de levadura modificado, tome una placa de múltiples pocillos que contenga la concentración deseada de un cultivo de células de levadura transformado y en crecimiento activo.

Estas células contienen una secuencia de ADN específica aguas arriba del gen indicador que codifica β-galactosidasa, impulsada por el promotor GAL-4, mientras que carecen de la proteína endógena del factor de transcripción GAL-4. Las células expresan una proteína diana fusionada con el dominio de activación GAL-4 y otra proteína que carece del dominio de unión al ADN GAL-4.

Si estas proteínas interactúan, podrían formar un complejo, lo que permitiría que la proteína diana se una a la secuencia de ADN aguas arriba en la región promotora del gen reportero. El dominio de activación de GAL-4 activa la expresión de la enzima β-galactosidasa reportera.

centrífuga. Vuelva a suspender las celdas en un tampón adecuado. Congele y descongele las células para lisarlas y liberar β-galactosidasa. Agregue beta-mercaptoetanol y un tampón que contenga sustrato de β-galactosidasa.

El beta-mercaptoetanol estabiliza la enzima β-galactosidasa. La β-galactosidasa hidroliza el sustrato de β-galactosidasa, formando un cromógeno amarillo.

Agregue una solución de carbonato de sodio para desnaturalizar la β-galactosidasa y detener la reacción. Centrífuga. Transfiera el sobrenadante que contiene cromógeno amarillo a una placa de pocillos múltiples. Con un lector de placas, mida la densidad óptica de la solución a una longitud de onda adecuada para calcular la actividad de la β-galactosidasa.

Una mayor actividad de β-galactosidasa indica interacciones positivas entre las proteínas y la secuencia de ADN diana, lo que conduce a la expresión de β-galactosidasa.

Vuelva a suspender el cultivo y transfiera 125 microlitros de cada pocillo a una placa de espectrofotómetro. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para asegurarse de que esté entre 0,3 y 0,6. Centrifugar las células restantes en el bloque de pocillos profundos a 3.000 veces g y 21 grados centígrados durante 10 minutos. Elimine el sobrenadante invirtiendo.

Agregue 200 microlitros de tampón Z a cada pocillo y vórtice. Centrifugar a 3.000 veces g y 21 grados centígrados durante 5 minutos. Elimine el sobrenadante invirtiendo. Agregue 20 microlitros de tampón Z a cada pocillo y vórtice. Cubra la placa con una lámina de sellado que sea resistente a los ciclos de congelación y descongelación.

En una campana extractora, realice cuatro ciclos de congelación-descongelación con nitrógeno líquido en un baño de agua a 42 grados centígrados. Agregue 200 microlitros de solución Z-buffer/beta-mercaptoetanol/ONPG recién preparada a cada pocillo. Incubar a 30 grados centígrados durante 17 a 24 horas o hasta que se desarrolle el color. Comprueba que el color se ha desarrollado.

Agregue 110 microlitros de carbonato de sodio 1 molar a cada pocillo para detener la reacción. Registre el tiempo y haga un vórtice en la placa. Centrifugar a 3.000 veces g y 21 grados centígrados durante 10 minutos. Utilice una pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a una placa de espectrofotómetro. Mida la densidad óptica a 420 nanómetros.