Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Para aislar las proteínas de unión al ARN, o RBP (reguladores postranscripcionales), se necesita una suspensión de pequeñas sondas de ARN que contienen un elemento rico en adenilato-uridilato, o ARE, una secuencia reconocida por los RBP objetivo. Las sondas de ARN están marcadas con destiobiotina, un derivado de la biotina.

Agregue perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina, una proteína con afinidad por la biotina. Incube bajo agitación para evitar que las perlas se asienten. El ARN marcado con destiobiotina se une a la estreptavidina, inmovilizando así el ARN en las perlas.

Bajo el campo magnético, las perlas se acumulan en el costado del tubo. Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en un tampón que proporcione un pH óptimo para la unión RBP-ARN.

Al exponerse al imán, las perlas se acumulan en el costado del tubo. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en una solución que contenga las RBP objetivo e incube bajo agitación.

Los RBP diana poseen motivos de reconocimiento de ARN que reconocen la secuencia ARE y se unen al ARN, formando así un complejo ARN-proteína inmovilizado en las perlas.

Bajo el campo magnético, las perlas se mueven hacia el i