Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Para aislar las proteínas de unión al ARN, o RBP (reguladores postranscripcionales), se necesita una suspensión de pequeñas sondas de ARN que contienen un elemento rico en adenilato-uridilato, o ARE, una secuencia reconocida por los RBP objetivo. Las sondas de ARN están marcadas con destiobiotina, un derivado de la biotina.

Agregue perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina, una proteína con afinidad por la biotina. Incube bajo agitación para evitar que las perlas se asienten. El ARN marcado con destiobiotina se une a la estreptavidina, inmovilizando así el ARN en las perlas.

Bajo el campo magnético, las perlas se acumulan en el costado del tubo. Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en un tampón que proporcione un pH óptimo para la unión RBP-ARN.

Al exponerse al imán, las perlas se acumulan en el costado del tubo. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en una solución que contenga las RBP objetivo e incube bajo agitación.

Los RBP diana poseen motivos de reconocimiento de ARN que reconocen la secuencia ARE y se unen al ARN, formando así un complejo ARN-proteína inmovilizado en las perlas.

Bajo el campo magnético, las perlas se mueven hacia el imán sin perturbar las interacciones proteína-ARN. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las perlas en un tampón de elución que contenga biotina.

La biotina desplaza la destiobiotina de las perlas al unirse competitivamente a la estreptavidina, eluyendo así el complejo proteína-ARN.

Evalúe la presencia de las RBP diana en el eluido para confirmar las interacciones proteína-ARN.

Prelavar 50 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina por 50 picomoles de ARN. Agite el tubo con perlas magnéticas de estreptavidina durante 15 segundos. Después de un vórtice rápido, retire 200 microlitros en un tubo de bloqueo seguro limpio de 1,5 mililitros con puntas de pipeta cortadas. A continuación, coloque el tubo en un soporte magnético para que las perlas se acumulen en el costado del tubo y espere un minuto. Retire el líquido de respensión.

Para lavar las perlas, retire el tubo del soporte magnético a 400 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar, solución de cloruro de sodio 0,05 molar y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y espere un minuto, luego, recoja el sobrenadante.

Lave las perlas con 200 microlitros de cloruro de sodio de 100 milimolares y retire el sobrenadante. Añadir 200 microlitros de Tris 20 milimolares. Vuelva a suspender las perlas pipeteando y coloque el tubo en el soporte magnético. Después de un minuto, retire el sobrenadante. Luego, retire el tubo del soporte magnético a 200 microlitros de tampón de captura de ARN 1x y vuelva a suspender las perlas magnéticas de estreptavidina mediante un vórtice breve.

Retire 50 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina y agréguelas a cada tubo de ARN marcado con una punta de pipeta cortada. Incube los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rodillo. Después de que el tubo haya estado en el soporte magnético durante un minuto, retire el sobrenadante. Agregue 50 microlitros de Tris de 20 milimolares a las perlas y vuelva a suspenderlas. Luego, coloque los tubos en el soporte magnético. Después de un minuto, retire el sobrenadante.

Agregue 100 microlitros de 1x tampón de unión proteína-ARN a las cuentas y vuelva a suspenderlas. Luego, vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético. Una vez que los tubos hayan estado en el soporte durante 1 minuto, recoja el sobrenadante. Agregue 100 microlitros de mezcla maestra B. Vuelva a suspender pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y evite crear burbujas. Incube los tubos de reacción durante 60 minutos a 4 grados centígrados en un rodillo.

Continúe con los pasos de lavado y elución. Coloque los tubos en un soporte magnético. Recoja el flujo y transfiéralo a un nuevo tubo. Pipetear 100 microlitros de tampón de lavado 1X en las perlas. Vuelva a suspender suavemente. Vuelva a colocarlos en el soporte. Espere un minuto y deseche el sobrenadante. Repita el paso dos veces.

Agregue 40 microlitros de tampón de elución a las perlas magnéticas. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en un agitador de tubos. Coloque los tubos en un soporte magnético, espere un minuto y recoja la muestra de eluido. Colóquelo en hielo y utilícelo para el análisis posterior.