Ensayo de unión in vitro basado en SELEX para identificar interacciones ARN-proteína

La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial, SELEX, permite la identificación de secuencias de ARN de unión a proteínas.

Primero, obtenga un grupo de ARN aleatorio que contenga ARN radiomarcados con secuencias aleatorias que se pliegan en estructuras altamente específicas. Incubar con la proteína objetivo. La proteína se une a moléculas de ARN con secuencias específicas y estructuras tridimensionales, mientras que los ARN no específicos permanecen libres.

Pasar la mezcla por un filtro de nitrocelulosa. El ARN no unido pasa a través de los poros del filtro, mientras que los complejos ARN-proteína permanecen retenidos.

Corta el filtro que contiene el complejo de proteínas de ARN en fragmentos. Repita la interacción ARN-proteína incubando el grupo de ARN con una concentración reducida de proteína diana, lo que permite solo la unión de secuencias de alta afinidad, mientras que las secuencias de baja afinidad no se unen.

Cargue esta mezcla en un gel de poliacrilamida y realice la electroforesis. Los complejos ARN-proteína migran lentamente a través del gel en comparación con los ARN no unidos de baja afinidad. Las imágenes de gel de rayos X muestran un cambio de banda correspondiente a la ubicación del complejo ARN-proteína.

Corta la porción de gel que contiene el complejo. Agregue proteinasa K a los fragmentos de filtro y rodajas de gel, digiriendo las proteínas y liberando ARN del complejo. Agregue fenol-cloroformo y centrifuge, separando el ARN de las proteínas digeridas.

Mezcle el sobrenadante que contiene ARN con acetato de sodio y etanol. Centrifugar para precipitar el ARN. Resuspender en agua libre de ARNasa. Transcribir el ARN a ADN complementario y amplificar el ADN por PCR.

Repita varias rondas de separación basada en filtros y en gel para obtener un conjunto de secuencias de ADN específicas de proteínas diana.

Para unir proteínas y ARN en un volumen de reacción de 100 microlitros, primero prepare 10 milimolares de trisclorhidrato a pH 7,5, que contengan 50 milimolares de cloruro de potasio, un milimolar de DTT, 0,09 microgramos por microlitro de albúmina sérica bovina, 0,5 unidades por microlitro de ARNsina, 0,15 microgramos por microlitro de ARNt y 1 milimolar de EDTA. Luego, agregue 30 microlitros de proteína recombinante PTB y 10 microlitros de ARN del grupo apropiado.

Coloque los tubos que contienen las reacciones de unión en un bloque de temperatura durante unos 30 minutos a 25 grados centígrados. A continuación, fraccione el ARN unido del ARN no unido a través de cuatro rondas de selección y amplificación. Primero, filtre la muestra de 100 microlitros a temperatura ambiente a través de un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío. El complejo ARN-proteína permanece en el filtro.

Con una cuchilla de afeitar estéril, corte el filtro en fragmentos e insértelos en un tubo de centrífuga. Sumerja las piezas del filtro en tampón de proteinasa K y colóquelo en un vaso durante un mínimo de tres horas o toda la noche para recuperar el ARN.

Para desproteinizar la muestra de ARN, agregue un volumen igual de fenol-cloroformo, vórtice. Y luego centrifugar a alta velocidad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Obtener la fase acuosa, y extraer con cloroformo de nuevo. Después de eso, mezcle el sobrenadante con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 molares a pH 5.2 y dos o tres volúmenes de etanol absoluto.

Deje el tubo en un congelador a -80 grados centígrados durante 30 minutos y luego centrifugue a alta velocidad durante 10 minutos. Repita los pasos de lavado y secado con etanol al 70% y solubilice el ARN en agua tratada con DEPC. Después de la primera ronda de ensayo de unión al filtro, realice tres rondas más.

A continuación, realice dos rondas de transcripción, unión y amplificación para separar las fracciones de ARN unidas a proteínas de las fracciones no unidas. Prefabricado un gel nativo de poliacrilamida al 5% con una proporción de acrilamida bisacrilamida de 60 a 1 en tampón TBE de 0,5x. Luego, configure la reacción de unión ARN-proteína.

Coloque el gel en un dispositivo de electroforesis lleno de tampón TBE 0,5x en una cámara frigorífica a 4 grados centígrados. Aplique 250 voltios durante 15 minutos y pipetee la reacción de unión en diferentes pocillos. Luego, además, fraccione el ARN unido del ARN no unido ejecutando la electroforesis a 250 voltios durante una o dos horas.

A continuación, exponga el gel a una película de rayos X e identifique la ubicación del ARN unido mediante autorradiografía. Corta la rebanada de gel con el ARN unido e insértala en un tubo. Triture la rodaja de gel e incube en el tampón de proteinasa K durante tres horas o toda la noche. Repita la extracción con fenol-cloroformo y cloroformo, como se describió anteriormente. Sintetizar ADNc a partir del ARN disuelto.

Prepare 20 microlitros de reacción, incluidos dos microlitros de tampón RT 10x, dos microlitros de transcriptasa inversa AMV, 1 microlitro de cebador inverso, 5 microlitros de agua y 10 microlitros del ARN disuelto. Incubar a 42 grados centígrados durante 60 minutos.

Amplifique el ADNc utilizando de 20 a 25 ciclos de PCR como se describió anteriormente. Repita el proceso de síntesis de ARN, unión de proteínas y separación de fracciones unidas y no unidas a proteínas.