Name: Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a realizar imágenes ex vivo de células T fluorescentes en rebanadas de ganglios linfáticos murinos utilizando microscopía de campo amplio y confocal. Este método permite analizar la migración celular en tiempo real.

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Los autores desean agradecer al Dr. Alain Trautmann, que nos animó a realizar cortes de ganglios linfáticos. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Ligue Nationale Contre le Cancer, la Fondation pour la Recherche Médicale en Francia y la Asociación para la Investigación del Cáncer-sur-le.

1. Rebanadas de la preparación de los ganglios linfáticos <ol><li> Preparar un 4% de bajo punto de fusión solución de agarosa para incrustar. Diluir agarosa en PBS y microondas esta solución. Cuando la agarosa se disuelva por completo, mantener la solución a 37 ° C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Prepare una placa de tejido de 6 pocillos. Añadir 1,1 ml de medio de cultivo RPMI completo por pozo, e insertar un filtro de organotípicos en cada pozo. Coloque la placa de 6 pocillos a 4 ° C hasta el momento de la transferencia de las rebanadas. </li><li> Coloque las arandelas de acero inoxidable, con un diámetro interior de 4 mm, en un plato de plástico llena de medio RPMI completo. Arandelas serán más utilizado para concentrar las células en el segmento de corte vibratome. </li><li> El sacrificio del ratón, de acuerdo con las normas locales de bienestar animal. Retire con cuidado los ganglios linfáticos periféricos del tejido circundante y colocarlas en un plato de plástico con helado de PBS. Se debe tener cuidado de no dañar la estructura de los ganglios linfáticos, ya que estos órganos son muy suaves. </li><li> Vierta el 4% en gel de agarosa en un plato de plástico de 35 mm y con delicadeza la transferencia de los nodos en el gel. Deje el gel de agarosa en hielo durante 5 min a endurecerse. </li><li> Retire el bloque de la antena y recortar el agar con el fin de salir de 3-5 mm de gel alrededor de cada uno de los ganglios linfáticos. </li><li> Conecte los nodos integrados en el disco de muestra del vibratome con adhesivo tisular no tóxico. Instale el disco muestra en la bandeja llena de helado de PBS. </li><li> La sección de agar de tejidos embebidos en el espesor de micras 320 con la velocidad vibratome conjunto en una serie lenta (0,3 mm / s) y la frecuencia de vibración establecidos en un rango medio (1,5 mm). </li><li> Con cuidado, la transferencia de las rebanadas de ganglios linfáticos, ya que se están reduciendo en los insertos de cultivo organotípico usando unas pinzas finas. Coloque 3 rebanadas en cada inserción. Tenga mucho cuidado en forma de filetes se pueden dañar fácilmente. Un nodo típico linfáticos periféricos producirán cinco secciones cuando se corta a 320 micras. Desechar las rodajas de primera y la última, ya que sólo contienen tejido superficial. </li><li> Coloque las arandelas de acero inoxidable en cada sector individual. Asegúrese de que las arandelas están bien posicionados en la agarosa alrededor del tejido. </li><li> Incubar la placa de cultivo a 37 ° C en un 5% de CO 2 humidificado incubadora hasta el momento de la placa de células T. </li></ol> 2. Aislar las células T de los ganglios linfáticos del ratón <ol><li> Aislar las células T de acuerdo con el artículo publicado anteriormente JoVe 3. </li><li> Utilizar las células T de inmediato y proceder a la siguiente sección. De lo contrario, los linfocitos pueden ser cultivadas durante la noche, en completo RPMI-medio suplementado con 10 ng / ml de IL-7. </li></ol> 3. Etiquetado de las células T aisladas <ol><li> Lavar las células en HBSS. Resuspender en el mismo tampón a 10 x 10 6 por ml. </li><li> Añadir el mismo volumen de HBSS conteniendo 1 mM celular Rastreador verde CMFDA dando una concentración final de 0,5 mM. </li><li> Incubar la suspensión de células a 37 ° C durante 5 min. Lavar las células dos veces con RPMI completo y medio plazo. </li><li> Resuspender las células a una concentración final de 10 x 10 6 por ml en RPMI completo y medio plazo. Estas células marcadas se sembraron en los cortes. </li></ol> Otros colorantes fluorescentes que CMFDA podría ser utilizado también, pero ten en cuenta que estas moléculas son potencialmente tóxicos por encima de ciertas concentraciones. 4. Revestimiento etiquetados células T en rodajas los ganglios linfáticos <ol><li> Retire el exceso de contenido medio en la parte interior de la lavadora con una pipeta. No permita que el tejido se seca, trabajar de forma rápida durante este paso. </li><li> Suavemente prescindir de 10 a 20 l etiquetados células T que corresponde a 1 a 2 x 10 5 células en la parte interior de la lavadora. Se debe tener cuidado de no tocar el tejido con la punta de la pipeta. Asegúrese de que la gota de suspensión celular se mantiene en su lugar. </li><li> Colocar las rebanadas con las células en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 por lo menos 30 minutos para permitir que los linfocitos migran hacia los tejidos. </li></ol> 5. Imágenes de las células T en rodajas los ganglios linfáticos En este video-artículo, las células T de imagen fluorescente en rodajas de ganglios linfáticos con un microscopio de campo amplio invertida y un microscopio confocal en posición vertical. <ol><li> Ajuste la temperatura a 37 ° C. Nuestros microscopios están equipados con cámaras de temperatura controlada. </li><li> Instalar un sistema de perfusión que permite la perfusión continua de la rebanada de ganglios linfáticos con oxigenada (5% CO2, 95% O 2) rojo fenol libre de medio RPMI. En nuestro sistema, los medios de comunicación perfusión entra en la cámara de imágenes de un lado por la gravedad. El medio es aspirado con una bomba conectada a un matraz de recogida de residuos. Establecer la velocidad de flujo de los medios de comunicación de 1 ml / min. </li><li> Con unas pinzas finas, delicadas sacar el trozo de la placa de 6 pocillos y se moje la preparación en caliente oxigenada medio RPMI durante unos segundos para deshacerse de células fluorescentes no se infiltraron en el tejido. </li></ol> Imaging células T con un microscopio invertido de gran campo <ol start="4"><li> Coloque el corte hacia abajo en una cámara de imágenes a medida que se compone de hilos de nylon pegado en la parte interior de un plato con fondo de cristal. En esta cámara, los hilos de nylon elevar el sector a partir de la copa y que la solución oxigenada de difundir en el tejido. Esto es necesario como la migración de las células T en los ganglios linfáticos es fuertemente dependiente de oxígeno. Asegurar el corte, añadiendo en él una arandela de acero inoxidable. En estas condiciones, el segmento se encuentra a unas pocas micras por encima del fondo del plato, lo que facilita la renovación de la solución de perfusión. </li><li> Para capturar un gran campo de visión (800 x 800 m, aproximadamente un tercio de la superficie de corte del nodo), recoger las imágenes con un lente de 10x objetivo seco. Se encontró que el 10 veces Nikon S fluor 0,5 NA era el más adecuado para nuestro análisis. </li></ol> Un típico experimento de time-lapse de imágenes ha capturado 5 aviones óptica que abarca una profundidad total de 50 micras en el axial (z) dimensión. Fluorescente las células T son generalmente imágenes en intervalos de entre 10 a 30 segundos durante 10 a 20 min. Imágenes de las células T con un microscopio confocal vertical El microscopio confocal utilizados en este protocolo es una Leica SP5 equipado con un objetivo de 20x de inmersión de agua (Olympus, 20x/0.95 NA). <ol start="6"><li> Asegurar la división para la etapa de formación de imágenes del microscopio. Nota: Por lo general, coloque una arandela en la preparación para inmovilizarlo. </li><li> Establecer una sesión de imágenes mediante la recopilación de una serie de imágenes a lo largo del eje z. A las células T de imagen en una estructura de tejido intacto, la posición de inicio se suele fijar entre 5 y 10 micras por debajo de la célula T primera etiqueta. </li></ol> 6. Los resultados representativos Siguiendo este video-protocolo que debe esperar para visualizar un gran número de células T fluorescentes acumuladas en la zona T del nodo, un fenómeno que ocurre normalmente en este entorno particular en vivo (Figura 1). En particular, las células T deben ser excluidos de las zonas de células B, que son por lo general sólo debajo de la cápsula. Un experimento exitoso también dará lugar a las células T reclutados en el tejido (Figura 2), mostrando un comportamiento muy móviles (Figura 3), en consonancia con los resultados publicados obtenidos en los ganglios linfáticos intactos 4. En promedio, la velocidad media de cada uno de las células T en lonchas deben ser cerca de 10 m / min (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Las células T se acumulan en una rebanada de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T (CMFDA, verde) se han añadido a un ganglio linfático corte 30 minutos antes de la adquisición de imágenes (imagen superior). La imagen es la proyección máxima de 5 imágenes hasta los 50 m en la dirección z. La imagen de campo claro se muestra en la parte inferior. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio de campo amplio. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Las células T son reclutados en una porción de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T (CMFDA, verde) se han añadido a un ganglio linfático corte 30 minutos antes de la adquisición de imágenes con un microscopio confocal. Las imágenes fueron capturadas en la superficie de corte (foto superior) y 40 m por debajo (foto inferior). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Las células T son muy móviles dentro de una porción de los ganglios linfáticos. Fluorescentemente marcado células T fueron estudiados durante 12 minutos usando un microscopio de campo amplio. Trayectorias individuales de las células T se muestran como un código de colores para representar las pistas desplazamientos cada vez mayor de azul (bajo número de células móviles) a rojo (células móviles de alta). Pistas se calcularon utilizando software Imaris. La línea blanca sigue el borde del nodo, mientras que el óvalo de puntos delimita la zona B de células putativo. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dentro de una porción de los ganglios linfáticos, la velocidad de las células T está cerca de 10 m / min. Las velocidades se calcularon utilizando software Imaris de pistas representado en la figura 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Hemos descrito una técnica sencilla, rápida y robusta para la generación de cortes de ganglios linfáticos, que se utilizan para investigar el comportamiento de las células T introdujo. En los últimos años, este método ha sido aplicado con éxito el uso del timo y las rodajas de los ganglios linfáticos para identificar los factores extracelulares controlar el posicionamiento de las células T y la motilidad de 1,5. También se ha utilizado para medir las respuestas de Ca 2 + en timocitos durante la selección positiva y en las células T en el reconocimiento de antígenos 2,6. El ensayo parte de superposición presenta ventajas e inconvenientes que merecen ser discutidos. Es de destacar que este sistema permite el acceso a los tejidos, muy útil si se necesita para manipular farmacológicamente rebanadas con el fin de interferir con el control molecular de la migración celular. Con posterioridad a la imagen, las cortes pueden ser procesadas para inmunohistoquímica para recoger más información sobre las estructuras que han sido fotografiadas. Por otra parte, la observación se puede hacer con un microscopio de fluorescencia tradicionales de campo amplio. Aunque la resolución no es tan buena como con un microscopio confocal o de dos fotones, y que la fototoxicidad es, en principio, más grave, con un fotón que con el microscopio de dos fotones, tiene la ventaja de la simplicidad, un costo más bajo y mayor elección de longitudes de onda de excitación. La imagen de las células T en un ganglio linfático intacto requiere la inyección intravenosa de linfocitos marcados que, posteriormente, el hogar de los órganos linfoides. Como hemos demostrado anteriormente 1, el ensayo de corte es perfectamente compatible con los experimentos de transferencia adoptiva. Sin embargo, el tiempo necesario para que las células T a la casa de los ganglios linfáticos pueden complicar el uso de colorantes fluorescentes que tienen una tendencia a salirse de las células a través del tiempo. Este es el caso de la Ca 2 + colorante fura-2. Con el reclutamiento rápido (&lt;30 min) de las células T en el tejido, el ensayo de corte ofrece la oportunidad de usar estos colorantes. Finalmente, este método tiene la gran ventaja de analizar las funciones de las células T en varios tejidos humanos mantiene viva. Este sistema experimental también presenta limitaciones que deben tenerse en cuenta. Los daños asociados con el corte pueden afectar el funcionamiento de las células T, especialmente en la región superficial del tejido cerca de la superficie de corte. A fin de evaluar la muerte celular en el sector, hemos utilizado el colorante fluorescente verde SYTOX que penetra en las células con la membrana plasmática comprometida. Nuestros experimentos muestran que alrededor del 20% del total de las células ganglionares, en su mayoría localizadas en la región superficial del tejido, fueron etiquetados con fluorescencia con este colorante nuclear. Otro problema potencial con el ensayo es la capacidad de los sectores para conservar importantes factores solubles como las quimiocinas. Aunque, no tenemos ninguna indicación de que nuestros datos se vieron afectados por este tipo de problemas ya que las células T muestran una buena movilidad en el sector, nos gustaría hacer hincapié en la importancia de la imagen de las células T en las regiones de salud ubicados en varias decenas de micrones de la superficie de corte. Considerando que, con esto se podría hacer con los microscopios tradicionales (o de campo amplio confocal), como en este protocolo, es probable que el ganglio linfático rebanada preparación combinada con dos fotones de imagen aumentará la resolución espacial en profundidad y reducir la fototoxicidad.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas finas </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 inserciones de Cultura mm </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Completo RPMI-medio se realiza mediante la adición de un 10% inactivado por calor suero fetal bovino y penicilina / estreptomicina </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Baja la temperatura de gelificación de agarosa, el tipo VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Cianoacrilato de butilo pegamento, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Arandelas de acero inoxidable, 4 mm de diámetro interior </td><td> Bricolaje </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rastreador de células verdes CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo de imágenes de células t en los ganglios linfáticos murino rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Células T naive continuamente el tráfico de órganos linfoides secundarios, incluyendo los ganglios linfáticos periféricos, para detectar antígenos expresados ​​raro. La migración de las células T en los ganglios linfáticos es un proceso complejo que implica factores celulares y químicos, incluyendo las quimioquinas. Recientemente, el uso de la microscopia de dos fotones ha permitido hacer un seguimiento células T en los ganglios linfáticos intactos y para obtener alguna información cuantitativa sobre su comportamiento y sus interacciones con otras células. Mientras que hay ventajas obvias para un sistema in vivo, este enfoque requiere una instrumentación compleja y costosa y ofrece un acceso limitado a los tejidos. Para analizar el comportamiento de las células T en los ganglios linfáticos murino, hemos desarrollado un ensayo de corte 1, originalmente creado por los neurobiólogos y adaptado recientemente a murino timo 2. En esta técnica, marcado con fluorescencia células T se colocan en la parte superior de una porción de ganglios linfáticos extremadamente preparado. En este video-artículo, la localización y la migración de las células T en el tejido se analiza en tiempo real con un campo amplio y un microscopio confocal. La técnica que complementa en vivo de dos fotones microscopía ofrece un método eficaz para la imagen las células T en su entorno natural y para dilucidar los mecanismos subyacentes de migración de las células T.

Este protocolo describe un método para células T de imagen fluorescente introducido en rodajas los ganglios linfáticos. La técnica permite en tiempo real, análisis de la migración de las células T con las tradicionales de fluorescencia de campo amplio o microscopios confocal.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Las células T ingenuas se desplazan continuamente hacia los órganos linfoides secundarios, incluidos los ganglios linfáticos periféricos, para detectar antígenos expresados raramente. La migración...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de linfocitos T fluorescentes en cortes de ganglios linfáticos mediante microscopía de campo amplio y microscopía confocal. Esto se logra primero extrayendo un ganglio linfático de un ratón e incrustándolo en agar de bajo punto de fusión. Luego, el ganglio se corta en secciones de 320 micrones de grosor con un vibrátomo.A continuación, se siembran linfocitos T teñidos con fluorocromo sobre una sección de ganglio linfático. Finalmente, los linfocitos T que han infiltrado la sección se visualizan mediante microscopía de campo amplio y microscopía confocal. En última instancia, se pueden obtener imágenes fijas y videográficas que muestran cómo los linfocitos T son reclutados hacia el ganglio linfático y qué tipo de comportamiento motil exhiben dentro del tejido linfático. Vale.La principal ventaja de estas técnicas de un metal existente, como la fotomicroscopía y los órganos intactos, es que aquí las células T pueden visualizarse en un sistema tridimensional con un microscopio convencional de campo claro. Y además, las preparaciones ligeras permiten el acceso al tejido. Comience por preparar una solución al 4 % de punto de fusión bajo. Prepare una solución disolviendo agarosa en PBS y calentando en microondas la mezcla resultante hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.Mantenga la solución a 37 grados Celsius hasta su uso. A continuación, llene un recipiente de plástico con RPMI. Complete los medios de cultivo y coloque arandelas de acero inoxidable con diámetros internos de cuatro milímetros en el recipiente.Llene otro recipiente con PBS frío con hielo, luego agregue aproximadamente 1,1 mililitro de RPMI. Medio de cultivo completo por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos. Inserte un filtro organotípico en cada pocillo de la placa de seis pocillos y coloque la placa a cuatro grados Celsius.Extraiga cuidadosamente los ganglios linfáticos periféricos de sus tejidos circundantes en un ratón sacrificado. Diseque los ganglios linfáticos con cuidado, ya que son muy blandos. Es muy importante eliminar toda la grasa del tejido porque es muy tóxica para las células.Coloque los ganglios linfáticos en el recipiente de plástico que contiene el PBS con hielo. Ahora vierta el gel de aro al 4% en un recipiente de plástico de 35 milímetros y transfiera delicadamente los ganglios al gel. Luego, coloque el aro en hielo durante cinco minutos para que endurezca; una vez que el aro haya endurecido, retire el bloque del recipiente y recorte el agar, dejando aproximadamente de tres a cinco milímetros de gel alrededor de cada ganglio linfático.Luego, utilice un pegamento no tóxico para fijar los nodos embebidos sobre el disco de muestra de un viome. Instale el disco de muestra en la bandeja extraíble del viome y llene la bandeja con PBS helado. Establezca la velocidad del viome en un rango lento y la frecuencia de vibración en un rango medio, y seccione el tejido embebido en agar con un grosor de 320 micrones.Deseche la primera rebanada ya que contiene solo tejido superficial, y luego use pinzas finas para transferir cuidadosamente las rebanadas del ganglio linfático a los insertos de cultivo organotípico conforme se van cortando. Coloque arandelas de acero inoxidable sobre cada rebanada individual, asegurándose de que las arandelas estén en el agar, rodeando pero sin cubrir el tejido del ganglio linfático. A continuación, incube la placa de cultivo con las rebanadas del ganglio linfático a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono.Mientras se preparan los linfocitos T para este paso, utilice cultivo nocturno de linfocitos T suplementado con IL-7 que fueron aislados mediante selección con perlas positivas para CD4 usando la purificación Miltenyi MACS, como se demostró en el artículo previamente publicado en JoVE por Matthew y Callaghan. Lave los linfocitos T en HBSS durante cinco minutos a 300 × g a 20 °C. Resuspenda los linfocitos en HBSS fresco a 10 × 10⁶ células por mililitro.Luego, agregue un micromolar de rastreador celular verde C-M-F-D-A a un tubo de HBSS y combine esta solución con la solución celular hasta una concentración final del colorante de 0,5 micromolar. Incube la suspensión celular durante cinco minutos a 37 grados Celsius. Luego, después de lavar las células dos veces con medio RPMI completo durante cinco minutos a 300 veces G y 20 grados Celsius, suspenda las células T marcadas a una concentración final de 10 veces 10 a la seis células por mililitro.En medio de cultivo completo RPMI fresco, retire las secciones del ganglio linfático del incubador. Elimine el exceso de medio contenido en el centro del lavador con una pipeta sin tocar el tejido. Con la punta de la pipeta, agregue suavemente de 10 a 20 microlitros de linfocitos T marcados en el centro del lavador.Asegúrese de que la gota de suspensión celular permanezca en su lugar. Incube los cortes y los linfocitos T durante al menos 30 minutos para permitir que los linfocitos migren hacia el tejido. Para comenzar la adquisición de imágenes, ajuste la cámara de control de temperatura del microscopio a 37 grados Celsius.Llene un sistema de fusión para permitir la perfusión continua del corte de ganglio linfático con medio RPMI libre de rojo de fenol oxigenado; llene y caliente también en este momento un pequeño recipiente de plástico con RPMI oxigenado. En el sistema mostrado aquí, el medio perfundido entra en la cámara de imagenación desde un lado por gravedad. El medio se aspira mediante una bomba conectada a un recipiente de desecho.Con pinzas finas, retire las secciones de ganglio linfático infiltradas por linfocitos T del incubador. Retire delicadamente una sección del placa de seis pocillos. Sumerja la sección en medio RPMI oxigenado y precalentado durante unos segundos para lavar las células fluorescentes que no han infiltrado el tejido.Luego coloque la sección recién lavada boca abajo en la cámara de imagen. Los hilos de nailon elevan la sección respecto al vidrio y permiten que la solución oxigenada se difunda hacia el tejido. Esto es necesario porque la migración de linfocitos T en los ganglios linfáticos depende fuertemente del oxígeno.Luego asegure la sección colocando una arandela de acero inoxidable encima para capturar un campo de visión amplio. Recolecte imágenes utilizando un objetivo seco de 10 aumentos. Transfiera la sección de ganglio linfático recién lavada, con la cara hacia arriba, a un recipiente de plástico.Coloque una arandela sobre la preparación para inmovilizarla. Ahora las secciones están listas para ser observadas mediante imagen. Instale la preparación sobre la platina del microscopio confocal vertical y enfoque con el objetivo de 20 aumentos.Luego inicie una sesión de adquisición de imágenes y comience la adquisición. C-M-F-D-A. Las células T marcadas en verde se agregaron a una sección de ganglio linfático 30 minutos antes de la adquisición de imágenes, como se observa aquí. La imagen es la proyección máxima de cinco imágenes que abarcan 50 micrones en la dirección Z, capturadas con un microscopio de campo amplio aquí.La misma figura puede observarse como una imagen de campo brillante en este video. Linfocitos T fluorescentes verdes que han infiltrado una sección de ganglio linfático se imagina con un microscopio de campo amplio durante nueve minutos. La animación representa una proyección Z de 50 micrones.Observe la migración activa de los linfocitos T dentro del corte. Las trayectorias de linfocitos T individuales del mismo campo microscópico se muestran aquí como rastros codificados por colores para representar su desplazamiento creciente, desde células poco móviles en azul hasta células altamente móviles en rojo. Los rastros se calcularon utilizando un Mars.La línea blanca indica el borde del ganglio, mientras que las elipses punteadas delimitan las zonas putativas de linfocitos B. Aquí, los linfocitos T añadidos a una sección de ganglio linfático fueron observados mediante microscopía confocal durante 10 minutos. La animación representa una proyección Z de 50 micrones.Sí, esta técnica puede adaptarse a otros tipos de tejido. Y lo interesante es que el corte en sí es la única manera de explorar los mecanismos subyacentes a la migración y localización de los linfocitos T en tumores humanos. Por ejemplo.

ex-vivo-imaging-t-cells-murine-lymph-node-slices-with-widefield

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo...

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Este video describe las imágenes de las células T CD8 residentes infiltrantes de tumores marcadas con anticuerpos acoplados fluorescentemente dentro de cortes de tumores de pulmón humanos. Esta técnica permite analizar en tiempo real la migración de linfocitos T CD8 mediante microscopía confocal.

Análisis en tiempo real de la migración de células T residentes en diferentes regiones tumorales mediante microscopía confocal

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Este protocolo describe un método de imagen residente tumor-infiltración T CD8 células con anticuerpos fluorescente acoplados dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la migración de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.

Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Aprende a realizar imágenes ex vivo de células T fluorescentes en rebanadas de ganglios linfáticos murinos utilizando microscopía de campo amplio y confocal. Este método permite analizar la migración celular en tiempo real.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

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