Espectroscopía de resonancia magnética nuclear para identificar múltiples fosforilaciones en proteínas

Las fosforilaciones múltiples en una proteína implican agregar grupos fosfato a la proteína en varias posiciones, específicamente en los residuos de serina y treonina.

Para identificar múltiples fosforilaciones en una proteína, comience con un tubo que contenga proteínas fosforiladas marcadas con nitrógeno-15, lo que ayuda a diferenciar los hidrógenos amida de otros hidrógenos en la proteína.

Agregue un compuesto de referencia de RMN interno para una medición precisa de las frecuencias de resonancia relativas. Transfiera la mezcla a un tubo de resonancia magnética nuclear o RMN. Inserte el tubo en una abertura giratoria y colóquelo en un espectrómetro de RMN.

La presencia de fosfatos exhibe efectos de extracción de electrones en los residuos de serina y treonina fosforilados. Como resultado, los hidrógenos amida de los residuos fosforilados parecen estar desprotegidos con densidades de electrones menores en comparación con los otros hidrógenos amida.

Los hidrógenos amida con diferentes entornos electrónicos experimentan campos magnéticos diferenciales alrededor de los núcleos, alcanzando estados de baja energía.

Aplique un breve pulso de radiofrecuencia para excitar los núcleos de hidrógeno a un estado de energía más alto a una frecuencia de resonancia específica basada en su entorno electrónico.

Durante la relajación, los núcleos vuelven a un estado de baja energía liberando la energía absorbida, que se detecta para producir una señal de RMN.

Grafique un espectro de RMN bidimensional que represente los hidrógenos amida individuales.

Compare el espectro de la proteína fosforilada con el de la proteína no fosforilada. La aparición de resonancias adicionales en el espectro de RMN de la proteína fosforilada confirma múltiples fosforilaciones.

Solubilizar 4 miligramos de ¹⁵N liofilizado y Tau fosforilado con ¹³C enriquecido con ERK en 400 microlitros de tampón de RMN. Agregue óxido de deuterio al 5% para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y TMSP de 1 milimolar como referencia de señal de RMN interna. Además, agregue 10 microlitros de una solución madre 40x de un cóctel completo de inhibidores de proteasa.

Transfiera la muestra en un tubo de RMN de 5 mililitros utilizando una jeringa electrónica con una aguja larga o utilizando una pipeta Pasteur. Cierre el tubo de RMN con el émbolo. Elimine las burbujas de aire atrapadas entre el émbolo y el líquido moviendo el émbolo.

Coloque el tubo de RMN en una ruleta. Utilice el medidor apropiado para ajustar su posición vertical en la ruleta, de modo que la mayor parte de la solución de muestra esté dentro de la bobina de RMN. A continuación, inicie el flujo de aire en el instrumento de RMN haciendo clic en "Elevación" en la ventana del sistema de control magnético. Coloque con cuidado la ruleta con el tubo en el flujo de aire en la parte superior del orificio del imán, luego, detenga el flujo de aire y deje que el tubo descienda a su lugar dentro del cabezal de la sonda dentro del imán.

Después de permitir que la muestra se equilibre a 25 grados Celsius, escriba 'atmm' en la línea de comandos para realizar un ajuste semiautomático y una coincidencia del cabezal de la sonda para optimizar la transmisión de potencia. Luego, haga clic en "Bloquear" en la ventana del sistema de control del imán para activar el bloqueo de frecuencia de campo del espectrómetro.

Inicie el procedimiento de corrección de compatibilidad para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra escribiendo primero 'topshim gui' en la línea de comandos para abrir la ventana de cuñas. Luego, haga clic en "Inicio" en la ventana de correcciones de compatibilidad. Compruebe la desviación estándar cero B residual para verificar que las cuñas sean óptimas.

A continuación, calibra el parámetro P1, que es la longitud de un pulso de radiofrecuencia de protones en microsegundos. Este parámetro es necesario para obtener una rotación de 90 grados de la magnetización del espín del protón. Apunte al pulso de 360 grados utilizando un espectro unidimensional de protones de agua.

Ajuste el desplazamiento de frecuencia estableciendo el parámetro 01 en la frecuencia del agua del protón en el espectro unidimensional. Finalmente, comience la adquisición de un espectro de protones unidimensional escribiendo 'zg' en la línea de comandos.