La técnica de espectroscopía de dicroísmo circular para estudiar las interacciones ADN-proteína
JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas biológicas
0 vistas • 4:38 min • July 8th, 2025
Las proteínas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP regulan la expresión génica en la cromatina compacta alterando la conformación del ADN de una manera dependiente de ATP.
Para estudiar las interacciones entre el remodelador de la cromatina y el ADN mediante espectroscopia de dicroísmo circular o CD, tome una solución de oligonucleótidos de ADN bicatenario. Caliente para desnaturalizar los oligonucleótidos y colóquelos en hielo.
El enfriamiento rápido hace que el ADN se renaturalice mientras forma estructuras secundarias. La región de transición de doble a simple hebra proporciona un sitio de unión óptimo para los remodeladores de cromatina.
Agregue el ADN enfriado por calor en una cubeta. Agregue un tampón que contenga remodelador de cromatina dependiente de ATP, ATP e iones de magnesio.
El remodelador se une al ADN, seguido de la unión del ATP con complejos de iones de magnesio a la proteína, activándola. El remodelador activado hidroliza el ATP, induciendo una conformación de bucle de tallo en el ADN.
Pase luz polarizada circularmente izquierda y derecha, con una diferencia de fase de 90°, a través de la muestra. El ADN ópticamente quiral absorbe la luz polarizada circularmente izquierda y derecha en diferentes grados.
La absorción diferencial, denominada dicroísmo circular, da como resultado que la luz transmitida esté polarizada elípticamente, lo que se mide como elipticidad. Dos picos positivos en longitudes de onda específicas en los espectros de CD confirman la estructura stem-loop.
Agregue EDTA para quelar los iones de magnesio, inhibiendo la actividad de la ATPasa.
Un cambio en los espectros de CD tras la quelación, que muestra un pico negativo y un pico positivo amplio en longitudes de onda específicas, indica la interrupción de la conformación del bucle del tallo en ausencia de hidrólisis de ATP.
Recoja los espectros de CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia. Utilice cubetas rectangulares o cilíndricas. Para limpiar las cubetas, lávelas con agua varias veces, luego, escanee el agua o tampón en la cubeta para verificar si está limpia.
Para las reacciones, use oligonucleótidos de ADN purificados por PAGE. Para un enfriamiento rápido, caliente el ADN a 94 grados centígrados durante 3 minutos en el bloque calefactor y enfríelo inmediatamente con hielo. Para un enfriamiento lento, después de calentar el ADN a 94 grados Celsius durante 3 minutos, déjelo enfriar a temperatura ambiente a una velocidad de 1 grado Celsius por minuto.
Para registrar los espectros de referencia, configure un total de 5 reacciones de control, una por una, en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Mantenga el volumen de reacción en 300 microlitros en todas las reacciones.
Para registrar los espectros de CD, configure un total de cinco reacciones experimentales una por una en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros.
Para grabar el escaneo, encienda el gas y encienda el espectrómetro CD. Después de 10 a 15 minutos, encienda la lámpara, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 grados centígrados.
A continuación, abra el software del espectro del CD y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados, el rango de longitud de onda de 180 a 300 nanómetros, el tiempo por punto a 0,5 segundos y el número de escaneo a 5. Luego, haga clic en Pro-Data Viewer, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con los detalles del experimento y la fecha.
A continuación, mezcle las reacciones de referencia y experimentales mediante pipeteo y transfiera con cuidado las mezclas de reacción una por una a la cubeta, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
Si realiza un experimento de curso de tiempo, incube las reacciones a 37 grados Celsius durante el tiempo requerido. Luego, realice el escaneo. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, magnesio y proteínas para detener la hidrólisis de ATP. Para inhibir completamente la actividad de la ATPasa, aumente la concentración de EDTA y el tiempo de incubación.
Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software y suavice los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos. Luego, trace un gráfico de longitud de onda contra la elipticidad media del residuo y analice los picos.
Descripción general
Este estudio investiga el papel de las proteínas remodeladoras de la cromatina dependientes de ATP en la regulación de la expresión génica mediante la alteración de la conformación del ADN. Mediante espectroscopía de dicroísmo circular (CD), se analizan las interacciones entre las remodeladoras de la cromatina y el ADN.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Remodelación de la cromatina
- Regulación de la expresión génica
- Técnicas biofísicas
Antecedentes
- La remodelación de la cromatina es esencial para la expresión génica en células eucariotas.
- Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP alteran la estructura del ADN para facilitar la transcripción.
- La espectroscopía de dicromatismo circular puede proporcionar información sobre la conformación del ADN.
- Comprender estas interacciones es crucial para elucidar los mecanismos de regulación génica.
Objetivo del estudio
- Explorar cómo los remodeladores de la cromatina interactúan con el ADN.
- Caracterizar los cambios conformacionales en el ADN inducidos por la hidrólisis de ATP.
- Utilizar la espectroscopía de dicroísmo circular como método para analizar estas interacciones.
Métodos Utilizados
- Preparación de oligonucleótidos de ADN bicatenario.
- Desnaturalización y renaturalización del ADN para formar estructuras secundarias.
- Unión de remodeladores de cromatina y ATP al ADN.
- Medición de espectros de CD para analizar cambios conformacionales del ADN.
Resultados principales
- Los espectros de CD mostraron picos distintos que indican la formación de una estructura en horquilla.
- La quelación con EDTA interrumpió la conformación en horquilla, confirmando el papel del ATP.
- Las reacciones de línea base y experimentales se registraron y analizaron con éxito.
- El suavizado de los datos y la elaboración de gráficos revelaron hallazgos significativos respecto a la estructura del ADN.
Conclusiones
- Los remodeladores de cromatina dependientes de ATP alteran significativamente la conformación del ADN.
- La espectroscopía de dicroísmo circular es un método eficaz para estudiar estas interacciones.
- El estudio mejora la comprensión de los mecanismos de regulación génica en la cromatina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La espectroscopía de dicroísmo circular permite reducir los riesgos mecanicistas de dianas remodeladoras de cromatina al proporcionar lecturas cuantitativas y sin marcadores de los cambios conformacionales del ADN. Esto apoya la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento, al vincular la actividad dependiente de ATP con resultados estructurales, informando decisiones de avance o interrupción en programas de descubrimiento de fármacos epigenéticos. La técnica ofrece confianza predictiva sobre el mecanismo de la diana antes del desarrollo de ensayos o campañas de cribado.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Analiza hipótesis terapéuticas mediante la medición de cambios estructurales en el ADN dependientes de ATP inducidos por remodeladores de cromatina.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas de elipticidad sin etiquetas que aclaran el mecanismo de acción sin necesidad de etiquetas fluorescentes.
- Valor predictivo: Permite la reducción de riesgos biológicos al confirmar la interacción con el blanco mediante cambios conformacionales en el ADN.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Genera espectros de CD reproducibles en cubetas de cuarzo bajo temperatura controlada (37°C) y rango de longitud de onda (180–300 nm).
- Resultado cuantitativo: Proporciona mediciones de elipticidad media por residuo que detectan la formación y ruptura de estructuras tipo horquilla mediante cambios en los picos.
- Reproducibilidad: La sustracción de la línea base y el suavizado de datos permiten comparaciones consistentes entre diferentes condiciones experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Mecanicista: Relaciona la actividad ATPasa con la conformación del ADN, apoyando la validación de objetivos alineada con biomarcadores en las vías epigenéticas.
- Avance Ajustado al Riesgo: El control de quelación con EDTA confirma la dependencia de ATP, permitiendo la priorización de compuestos basada en mecanismos.
- Relevancia Traduccional: La conformación en horquilla actúa como un indicador estructural para ensayos funcionales posteriores en biología de la cromatina.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Situada entre la hipótesis del blanco y la identificación de compuestos activos, la espectroscopía de dicroísmo circular valida la interacción mecanicista antes del cribado de compuestos, reduciendo los falsos positivos en programas con objetivos epigenéticos.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la hipótesis de interacción entre remodeladores de cromatina y ADN mediante la observación directa del cambio conformacional impulsado por ATP.
- Tamizaje: Prepara sustratos de ADN estandarizados y con conformación definida para ensayos fiables de unión o inhibición de compuestos.
- Análisis: Mide la elipticidad a longitudes de onda específicas para cuantificar estados estructurales, permitiendo la comparación entre condiciones con y sin ATP.
- Investigación Traducional: Proporciona un vínculo mecanicista desde la validación del blanco hasta modelos preclínicos, al confirmar el remodelado del ADN dependiente de ATP.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma biofísica reutilizable para el tamizaje de compuestos dirigidos al cromatina en múltiples familias de remodeladores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos de cromatina mediante lecturas estructurales directas.
- Valor operativo: Permite la estandarización mediante protocolos de limpieza de cubetas, controles de línea base y mediciones con temperatura fija.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir riesgos en los objetivos desde una etapa temprana, minimizando la inversión en compuestos no mecanicistas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos epigenéticos basada en la validación conformacional dependiente de ATP.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectroscopía biofísica y manipulación de ácidos nucleicos.
- Depende de un espectrómetro de CD, cubetas de cuarzo y un baño de agua con control de temperatura.
- Necesita condiciones estandarizadas de tampón y sustracción de la línea base para garantizar la precisión de los datos.
- La adaptación a otras estructuras de ácidos nucleicos puede requerir la optimización de las condiciones de renaturalización.
- Se limita a sistemas solubles y purificados; no es adecuado para formatos de alto rendimiento ni basados en células.
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Última actualización: 29 agosto 2026