Un inmunoensayo directo basado en espectroscopia Raman para detectar un antígeno específico

Comience incubando moléculas de colorante reportero Raman con nanopartículas de oro para que los reporteros se unan a las nanopartículas.

Agregue polietilenglicol, anticuerpos conjugados con PEG específicos para el antígeno diana. Los anticuerpos se adhieren covalentemente a las nanopartículas a través de la unión de disulfuro de oro. Agregue PEG conjugados con tiol para bloquear los sitios de nanopartículas restantes y evitar la agregación de nanopartículas, formando sondas de nanopartículas.

Cubra los pocillos de la placa de inmunoensayo con el antígeno diana. Bloquee los sitios restantes de la placa con una solución que contenga proteínas. Agregue las sondas de nanopartículas. Realice la dilución de la sonda en serie a través de los pocillos. Incubar para que los anticuerpos de las sondas se unan a los antígenos, formando complejos.

Utilice un microscopio Raman para determinar la respuesta óptica de la sonda. El láser monocromático incidente excita los electrones de la superficie de las nanopartículas de oro y provoca su oscilación, creando un alto campo electromagnético local en la superficie de la sonda.

El haz incidente y los reporteros Raman interactúan, causando una luz inelástica mejorada o dispersión Raman con diferentes longitudes de onda y frecuencias debido al campo electromagnético mejorado. La señal Raman emitida de forma inelástica se utiliza para generar el espectro Raman.

Trace el área espectral del pico reportero Raman contra la concentración de la sonda para encontrar el límite inferior de detección de la sonda y facilitar una detección más sensible del antígeno.

Para preparar las sondas Raman, primero haga dos lotes de 1,5 mililitros de nanopartículas de oro y el reportero Raman en concentraciones determinadas como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Esto se hace combinando el reportero Raman y las soluciones de nanopartículas de oro y permitiéndoles unirse durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue la solución de anticuerpos PEGilados a una de las soluciones de nanopartículas de oro unidas al reportero para crear una proporción de 200 a 1 de anticuerpos a partículas. Esta solución será para las muestras de prueba.

En un tubo de microcentrífuga separado, agregue un antígeno pegilado a la otra solución de nanopartículas de oro unida al reportero en una proporción de 200 a 1 de antígeno a partículas que se utilizará como control. Incube ambas soluciones durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, bloquee los sitios restantes en la superficie de la nanopartícula. Para lograr esto, primero, disuelva el metoxipolietilenglicol tiol sólido a una concentración de 200 micromolares usando agua HPLC. Agite la solución hasta que el tiol se disuelva por completo. Luego, agregue la solución de tiol en una proporción de 40,000 a 1 a las soluciones de anticuerpos PEG unidas a nanopartículas e incube la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos para asegurarse de que los sitios restantes en la nanopartícula de oro estén bloqueados.

A continuación, recupere las sondas Raman funcionalizadas centrifugando las partículas en tubos de centrífuga de baja unión para que el sobrenadante sea transparente. Retire el sobrenadante pipeteando, pero tenga cuidado de no alterar las nanopartículas. Luego, vuelva a suspender las nanopartículas con 1 mililitro de PBS.

Estime la concentración de nanopartículas de oro tomando una medición UV-Visible de aproximadamente tres microlitros de la solución y compare los resultados con los de una concentración conocida de nanopartículas de oro, ya que esta es una relación lineal.

Si las nanopartículas no están lo suficientemente bloqueadas, se agregarán debido a las fuerzas de adhesión entre partículas que sugieren que los reactivos se agregaron en concentraciones incorrectas. Normalmente, la solución es de un color rojo intenso, pero la agregación crea un tono gris.

Ajuste el volumen de modo que las soluciones finales sean de al menos 1 x 10¹¹ partículas por mililitro y almacene las soluciones a 4 grados Celsius hasta que se utilicen para funcionalizar la placa de inmunoensayo. Utilice estas soluciones en el plazo de una semana. Primero, prepare suficiente antígeno diluido para llenar los pocillos de poliestireno. Luego, agite la solución e inmediatamente agregue la solución a los pocillos de las placas.

Deje que el antígeno se una a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, elimine el exceso de solución de antígeno vertiendo la solución y golpeando el plato contra una mesa cubierta con toallas de papel. Agregue TBST a los pocillos para lavar la superficie. Luego, retire el lavado volcando nuevamente la solución y golpeando el plato contra una mesa cubierta con toallas de papel.

A continuación, bloquee los sitios de unión restantes en la placa para evitar la unión inespecífica agregando 70 microlitros de solución bloqueadora de HSA a cada pocillo de la placa e incubando la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, retire la solución de bloqueo y enjuague la placa tres veces con TBST, como se demostró anteriormente. Después de retirar el enjuague final, cubra el plato y guárdelo seco a 4 grados centígrados hasta su uso posterior.

Agregue 140 microlitros de las nanopartículas de la sonda previamente preparadas en la primera columna de una placa de 96 pocillos, colocando las nanopartículas de prueba en las primeras cinco filas y las nanopartículas de control en las últimas tres filas. Agregue 70 microlitros de PBS a todas las demás columnas.

Diluya cada columna usando una dilución de 1 a 2 series. Comience tomando 70 microlitros de la primera columna y mezclándolos con la segunda. Luego, tome 70 microlitros de la segunda columna y agréguelos a la tercera, y así sucesivamente. Deje que el plato se incube durante al menos una hora.

A continuación, retire las sondas de nanopartículas no unidas y lave la placa con TBST cinco veces como se demostró anteriormente. Después del lavado final, agregue 70 microlitros de PBS a cada pocillo y cubra la placa con un sello de placa. Compruebe que las muestras de control sean transparentes. Si se ha producido un enlace no específico, las muestras de control tendrán un color similar al de las muestras de prueba.

Usando un microscopio Raman invertido, enfoque el objetivo en la superficie del pozo que tiene las sondas de nanopartículas de oro. Obtener espectros Raman del pozo. Reúna un espectro que vaya desde 1800 centímetros inversos hasta 400 centímetros inversos y repita esto para cada pozo. Finalmente, siga los pasos de la sección final del protocolo de texto adjunto para determinar la sensibilidad de la configuración.