Name: Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: Aprende técnicas de revestimiento aséptico para aislar, propagar y enumerar microorganismos como bacterias y fagos. Este método incluye siembra en estría, siembra por vertido y siembra por extensión para investigación microbiológica.

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Un agradecimiento especial a Cori Sanders en los diseños de Iroc para la preparación de las ilustraciones y Kris Reddi y Bhairav ​​Shah en la UCLA para el establecimiento de cultivo de las muestras y ayudando con las cifras. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el HHMI (HHMI Grant N º 52.006.944).

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<li>Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Research+Center+for+Beef+Genetic+Technologies.+In+vitro+detection+and+primary+cultivation+of+bacteria+producing+materials+inhibitory+to+ruminal+methanogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.</a> Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).</li>
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<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22A+Short+Course+in+Bacterial+Genetics%3A+A+Laboratory+Manual+and+Handbook+for+Escherichia+coli+and+related+bacteria%22">A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).</li>
<li>Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+modification+to+the+Copacabana+method+for+spreading+transformation+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures.</a> BioTechniques. 39, 188(2005).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Sanders, E. R., Miller, J. H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanders%2C+ER+%22Microbiologist%3A+A+Discovery-based+Course+in+Microbial+Ecology+and+Molecular+Evolution%22">Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution</a>. , ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Slonczewski, J. L., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlonczewski%2C+JL+%22Microbiology+-+An+Evolving+Science%22">Microbiology - An Evolving Science</a>. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
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<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html">http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html</a> (2012).</li>
<li>The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
<li>Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov">http://water.epa.gov</a> (2012).</li>
<li>American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

No tengo nada que revelar.

El cultivo de microorganismos implica una serie de métodos para galvanizado, todas las cuales requieren que la técnica aséptica se mantiene durante toda la manipulación de las células y los medios. Cinco diferentes procedimientos se describen en este protocolo. Aunque estas técnicas de recubrimiento se utilizan habitualmente para manipular las bacterias y los fagos, también puede ser aplicado a cultivos de células de mamíferos y microorganismos eucarióticos comúnmente utilizado en la genética molecular tales como la levadura (es decir, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), algas y protozoos ( es decir, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium), y los nematodos (es decir, el Caenorhabditis elegans). También son numerosos (y aún más sofisticados) las variaciones de cada técnica de siembra en función del objetivo experimental u organismo objeto de estudio. Por lo tanto, es importante no sólo seleccionar la técnica más adecuada para un microorganismo dado experimento u objetivo, sino también para adaptar la metodología t talessombrero de los resultados experimentales se ocupe adecuadamente de la pregunta de investigación o problema. Algunas de las aplicaciones más actuales de las técnicas de recubrimiento descritos en este protocolo la que producen los avances tecnológicos de alto rendimiento para los resultados de los experimentos de detección de drogas y de descubrimiento. Por ejemplo, centros de secuenciación del genoma de utilizar el &quot;Método de Copacabana&quot; de bibliotecas de clones de enchapado propagación, que son E. células de E. transformadas con plásmidos que contienen fragmentos de ADN derivadas del genoma de un microorganismo. Debido a decenas de grandes placas (llamado bandejas bioensayo) se preparan a la vez, un agitador de placas automático se utiliza para agitar las perlas de vidrio para todo el lote de bandejas. Por otra parte, la selección de colonias de estas placas después de la incubación, un selector de la colonia robótica se utiliza para recoger las células de las colonias adecuadas como el inóculo de caldo de LB en microplacas de 384 pocillos. Para este ensayo de cribado de alto rendimiento, los principios procesales de la difusión-ptécnica de fines de aplicar, pero la tecnología permite a los distintos pasos a ser automatizado y ampliado para permitir un gran número de muestras a analizar de forma simultánea y en un corto período de tiempo. Las empresas de biotecnología y farmacéuticas invierten recursos considerables en el desarrollo de tecnología de alto rendimiento para las técnicas más básicas de microbiología y genética molecular. Por ejemplo, hay varios canales Micropipetas para realizar transferencias de volumen de hasta 8 ó 12 muestras a la vez. Incluso hay estaciones de trabajo robóticos que maniobra una cabeza de 96 canales de pipeta! Estos esfuerzos implican equipos multidisciplinares de científicos, biólogos vinculación que poseen los conocimientos metodológicos con los ingenieros y programadores de computadoras que pueden desarrollar los instrumentos necesarios para realizar las operaciones mecánicas asociadas a los experimentos. Independientemente de la aplicación de la investigación, el objetivo compartido por empresas que desarrollan estas tecnologías es la misma - para automatizar los laboratoriosry procesos, herramientas, sistemas e instrumentos, haciéndolos menos mano de obra intensiva y más eficiente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Agar triptona de levadura (YTA)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Extracto de levadura</td>
			<TD>2.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<TD>10.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>15.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>pH 7.0</td>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Almacenar a 4 ° C 
Si prepara tubos para el procedimiento de placa de vertido, deje que el agar se enfríe a ~55&deg; C luego agregue 2,0 ml de 50 mg / ml de cicloheximida. Dispense asépticamente 18,0 ml del agar fundido por tubo de 18 mm y luego guárdelo a 4 ° C. El agar se solidificará y deberá derretirse en una vaporera o microondas antes de su uso.
2. Agar de sales mínimas (MSA) + 0,1% (p/v) de fuente de carbono
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<TD>1.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<TD>2,14 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<TD>1,09 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<TD>0,2 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuente de carbono*</td>
			<TD>1.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solución de sales traza**</td>
			<TD>10,0 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>15.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>pH 7.0</td>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Almacenar a 4 ° C 
* Las fuentes de carbono utilizadas para los experimentos presentados en la Figura 13 incluyen acetamida, lactosa y glicina.
** La solución de sales traza se prepara en HCl 0,1 N de la siguiente manera. Se agrega a la base antes de la esterilización (autoclave a 121 ° C; C durante 20 minutos).
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<TD>300.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<TD>180.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<TD>130.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<TD>40.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<TD>20.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<TD>1.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<TD>1000.0 mg</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (0,1 N)</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
3. Agar blando EHA (0,65 % p/v)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>6,5 g</TD>
			<TD></TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>Triptona</td>
			<TD>13.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>NaCl</td>
			<TD>8.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<TD>2.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>Glucosa</td>
			<TD>3.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Almacenar a 4 ° C 
4. Agar duro EHA (1,2% p/v)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>12.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<TD>13.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<TD> 8,0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<TD> 2,0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosa</td>
			<TD> 3,0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Almacenar a 4 ° C 
5. 1X Agar superior Middlebrook (agar blando MBTA, 0,5% p/v)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 stock*</td>
			<TD> 1 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 medio líquido: Neat **</td>
			<TD>50 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<TD>50 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Derretir 50 ml de 2XTA y dejar enfriar a ~55°C. Utilizando una técnica aséptica, añadir el caldo de CaCl2 y 7H9 al agar derretido. Dispense asépticamente 4,5 ml de la mezcla por tubo de 13 mm y guárdela a una temperatura de 55 ° C; Incubadora C &#8804; 7 días. Enfriamiento de MBTA a temperatura ambiente o 4 ° C hará que el CaCl2 se precipite fuera de la solución.
* 100 mM CaCl2. el caldo debe almacenarse a temperatura ambiente para evitar que el CaCl2 se precipite fuera de la solución.
** 7H9 medio líquido: Puro
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<base de caldo td>7H9</td>
			<TD>4,7 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD>40% de existencias de glicerol</TD>
			<TD>5 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 900,0 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Mezcle la base con agua y luego agregue el glicerol mientras revuelve. Autoclave a 121° C durante 20 minutos para esterilizar. Almacenar a 4 ° C 
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% p/v)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<base de caldo td>7H9</td>
			<TD>4,7 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>1.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml </TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Dispense alícuotas de 50 ml en botellas de 100 ml y guárdelas a 4 ° C. 
6. Placas de agar Middlebrook 7H10 (agar duro MHA, 1,9% p/v)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>7H10 base de agar</td>
			<TD>19,0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD>40% de existencias de glicerol</TD>
			<TD>12,5 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>887,5 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Mezclar la base de agar con agua y luego añadir el glicerol sin dejar de remover. Caliente la solución hasta que hierva y luego revuelva durante un minuto para disolver completamente el polvo base. Autoclave a 121° C durante 20 minutos para esterilizar. Deje que el agar se enfríe a ~ 55 ° A continuación, C añade asépticamente los siguientes reactivos:
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			Suplemento <td>AD (precalentado a 37&deg; C)*</td>
			<TD>100 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/ml Carbenicilina **</td>
			<TD>1,0 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml de cicloheximida **</td>
			<TD>1,0 ml</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
* Suplemento de AD
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>NaCl > </TD>
			<TD>17 g > </TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albúmina (Fracción V)> </TD>
			<TD>100 g> </TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>dextrosa (D-glucosa)> </TD>
			<TD>40 g> </TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada> </TD>
			<TD>hasta 2000,0 ml> </TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Esterilizar con filtro esta solución; No esterilizar en autoclave. Almacenar a 4 ° C 
** Esterilizar con filtro y almacenar estas soluciones a 4&deg; C para &le; 60 días.
7. Agar LB (1,5% p/v) + X-Gal (60 &mu; g/ml)
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<TD>10.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracto de levadura</td>
			<TD>5.0 G</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<TD>10.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<TD>15.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua destilada</td>
			<TD>hasta 1000,0 ml</TD>
		</tr>
		<tr>
			<TD></TD>
			<td>pH 7.5 a 25&deg; C</td>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Autoclave a 121&deg; C durante 20 minutos para esterilizar. Deje que el agar se enfríe a ~ 55 ° C luego agregue asépticamente 3,0 ml de 20 mg / ml de solución X-Gal. Preparar caldo de X-gal recién preparado disolviendo 400 mg de X-Gal en 20 ml de dimetilformamida (DMF). 
Tabla de reactivos específicos:
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Nombre del reactivo</td>
			<td>Company</td>
			<td>Número de catálogo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracto de levadura</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>212750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<TD>211705</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>214030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<TD>123340010</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<TD>230391 </TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamida</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>A-0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactosa</td>
			<td>Fisher Scientific </td>
			<td>L6-500 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3634</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<TD>230375</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<TD>213621000</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<TD>209198 </TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicloheximida</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>038K1561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbenicilina</td>
			<td>Cellgro</td>
			<TD>46-100-RG</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S279-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosa (Dextrosa)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</tr>
		<tr>
			<base de caldo td>7H9</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10 base de agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glicerol</td>
			<td>Shelton</td>
			<TD>IB15760</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albúmina (fracción V)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S71907</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&#946;-D-galactopiranósido) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimetilformamida (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CDA19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blanqueador de cloro</td>
			<td>Chlorox</td>
			<TD>02490/06644884</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>CiDecon (desinfectante)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<TD>8504</TD>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla>
Tabla de equipos específicos:
<borde de la tabla = "1">
	< >
		<tr>
			<td>Nombre del equipo</td>
			<td>Company</td>
			<td>Número de catálogo</td>
			<td>Experimento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucles metálicos</td>
			<td>Productos educativos estadounidenses</td>
			<td>S17352</td>
			<td>Recubrimiento de rayas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bucles de plástico desechables</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Recubrimiento de rayas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palos de madera</td>
			<td>Fisher</td>
			<TD>23-400-104</TD>
			<td>Recubrimiento de rayas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palillos planos</td>
			<td>Productos educativos estadounidenses</td>
			<td>S67859</td>
			<td>Recubrimiento de rayas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesas giratorias</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>Enchapado extendido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varillas de vidrio</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<TD>NC9004380</TD>
			<td>Enchapado extendido</td>
		</tr>
		<tr>
			<perlas de vidrio >4 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>Enchapado extendido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paño de terciopelo</td>
			<td>Productos Bel-Art</td>
			<TD>09-718-2</TD>
			<td>Revestimiento de réplica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bloque cilíndrico</td>
			<td>Productos Bel-Art</td>
			<TD>09-718-1</TD>
			<td>Revestimiento de réplica</td>
		</tr>
	</cuerpo>
</tabla></td></tr></tbody></table>

técnicas de laboratorio asépticas: métodos de revestimiento

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Los microorganismos están presentes en todas las superficies inanimadas creando fuentes ubicuos de posible contaminación en el laboratorio. Experimental éxito depende de la capacidad de un científico para esterilizar las superficies de trabajo y equipos, así como evitar el contacto de los instrumentos y soluciones estériles con superficies no estériles. A continuación les presentamos los pasos a seguir para varios métodos de galvanoplastia usados ​​rutinariamente en el laboratorio para aislar, propagar, o enumerar los microorganismos como las bacterias y fagos. Los cinco métodos incorporar una técnica aséptica, o procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales. Los procedimientos descritos incluyen (1) planchas de rayas cultivos bacterianos para aislar colonias individuales, (2) verter planchas-y (3) difusión de galvanoplastia para enumerar las colonias de bacterias viables, (4) superposiciones de agar blando para aislar fagos y placas de enumerar, y ( 5) réplica de galvanoplastia para transferir las células de una placa a otra en un patrón espacial idéntica. Estos procedimientos se pueden realizar en el instante tque banco de laboratorio, siempre que implican cepas no patógenas de microorganismos (Nivel de Bioseguridad 1, BSL-1). Si se trabaja con organismos BSL-2, a continuación, estas manipulaciones debe tener lugar en un gabinete de bioseguridad. Consulte la edición más actual de la Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL), así como las Hojas de Datos de Seguridad (MSDS) para sustancias infecciosas para determinar la clasificación de riesgo biológico, así como las medidas de seguridad e instalaciones de contención necesarios para el microorganismo en cuestión. Cepas bacterianas y las poblaciones de fagos se pueden obtener de los investigadores de investigación, empresas y colecciones mantenidas por organizaciones particulares, tales como la American Type Culture Collection (ATCC). Se recomienda que no patógenas cepas se utiliza cuando el aprendizaje de las diferentes métodos de enchapado. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los estudiantes deben ser capaces de: <ul><li> Realizar procedimientos de planchas sin contaminating los medios de comunicación. </li><li> Aislar un solo colonias de bacterias por el método de rayas placas. </li><li> Utilizar métodos de vertido de placas y propagación deposición electrolítica para determinar la concentración de bacterias. </li><li> Realizar superposiciones agar blando cuando se trabaja con fagos. </li><li> Transferencia de células bacterianas de una placa a otra mediante el procedimiento de réplica de galvanoplastia. </li><li> Dada una tarea experimental, seleccione la técnica de siembra adecuada. </li></ul>

Cuando se trabaja con medios y reactivos utilizados para los microorganismos de cultivo, una técnica aséptica debe ser practicada para asegurar la contaminación se minimiza. Una variedad de métodos de enchapado se utilizan habitualmente para aislar, propagar, o bacterias enumerar y fagos, todos los cuales incorporan procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales.

Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[Narrador] Este protocolo incorpora técnicas asépticas en métodos de siembra utilizados para aislar, propagar o enumerar microorganismos como bacterias y fagos. Los procedimientos incluyen la siembra por estrías de cultivos bacterianos para aislar colonias individuales, la siembra por vertido para determinar la concentración de bacterias y la siembra por extensión para enumerar colonias bacterianas viables. Se utilizan capas delgadas de agar para aislar fagos y enumerar placas, mientras que la siembra por replica permite transferir células de una placa a otra manteniendo un patrón espacial idéntico. En última instancia, las aplicaciones prácticas de estas técnicas para el cultivo de microorganismos abarcan desde la identificación de bacterias en ambientes hasta avances tecnológicos en genética molecular y bioensayos de alto rendimiento.Por lo general, las personas nuevas en estos métodos de siembra pueden tener dificultades porque las manipulaciones requieren movimientos cuidadosos y coordinados, evitando el contacto con superficies no estériles. Aprender estos procedimientos rutinarios requiere capacitación y práctica. Quien demostrará los procedimientos será mi coordinador de laboratorio, el Dr. Kris Reddi.- [Narrador] Comience a trabajar con microorganismos conociendo las normas de laboratorio y las precauciones de seguridad, incluyendo la clasificación de riesgo biológico, la descontaminación y la eliminación de residuos. Confirme que todos los instrumentos, soluciones y medios para los procedimientos de siembra sean estériles. Asimismo, establezca un área de trabajo limpia. Límpiela con desinfectante. Configure un mechero Bunsen con un tubo conectado a una línea de gas, organice los materiales necesarios etiquetados adecuadamente. Proceda a lavarse las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia. Primero, moje las manos con agua corriente tibia, luego aplique y distribuya abundantemente el jabón. Frote vigorosamente las manos generando fricción sobre todas las superficies, incluyendo los pulgares, el dorso de los dedos, el dorso de las manos y debajo de las uñas. A continuación, enjuáguelas completamente para eliminar el jabón residual y séquelas con toallas de papel dispensadas desde un portatoallas. Finalmente, con una toalla de papel nueva, cierre el grifo. El procedimiento de siembra por estrías está diseñado para aislar cultivos puros de bacterias, o colonias, a partir de poblaciones mixtas mediante una separación mecánica simple. Retire una placa de agar de una caja fría a cuatro grados Celsius y precáliele a temperatura ambiente. Seleccione una herramienta del conjunto de instrumentos para sembrar la placa. Asegúrese de que la placa esté seca y sin condensación en la tapa. Etiquete la base de la placa de agar alrededor del borde. Cuando tenga destreza, utilice una sola placa para múltiples muestras. Luego encienda el mechero Bunsen para flamear el asa metálica. Comience a tres o cuatro pulgadas del asa metálica, colocando el alambre en la punta del cono azul, la parte más caliente de la llama del mechero Bunsen. Cuando el metal se ponga al rojo vivo, mueva el alambre para que la llama alcance el asa. Para enfriar el asa, tóquela al borde del medio de agar, generando un sonido de chisporroteo. Continúe recogiendo el inóculo en el asa. Levante la mitad inferior de la placa. Mueva el asa de adelante hacia atrás desde el borde hasta el centro en el primer cuadrante de la placa. Coloque la placa invertida nuevamente sobre la tapa. Vuelva a flamear el asa metálica. Gire la placa Petri 90 grados. Toque el asa cerca del final de la última estría usando el patrón de ida y vuelta, cruce la mitad final de las estrías en el primer cuadrante y luego avance hacia el segundo cuadrante vacío. Una vez completado el segundo cuadrante, coloque la placa. Repita el procedimiento de siembra para el tercer y cuarto cuadrantes, evitando el contacto con el primer cuadrante. Para sembrar con un palillo estéril plano, sostenga el extremo estrecho suavemente entre el pulgar y el dedo anular a un ángulo de 10 a 20 grados respecto al medio, y use el extremo ancho para sembrar los cuadrantes. Invierta la placa sobre la tapa entre cuadrantes y deseche el palillo adecuadamente. Proceda a incubar las placas sembradas boca abajo. El procedimiento de siembra por vertido permite enumerar el número total de unidades formadoras de colonias en la superficie y dentro del agar de una sola placa. Configure un temporizador durante 10 minutos, luego transfiera 18 mililitros de medio de agar fundido desde un baño de agua a 55 grados Celsius hasta un bloque térmico a 48 grados Celsius y equilibre durante 10 minutos. Etiquete la base de una placa Petri estéril. Si aplica, incluya el factor de dilución. Ahora, dispense un mililitro de muestra en el centro de la placa Petri. Cierre la tapa. Retire la tapa del tubo de agar fundido y pase el borde del tubo abierto por la llama. Vierta cuidadosamente el agar en la placa Petri. Cierre la tapa y luego mezcle la muestra con el agar girando suavemente la placa. Espere 30 minutos para permitir que el agar se solidifique. Una vez que el agar se haya solidificado, invierta la placa y colóquela en un cuarto cálido. La siembra por extensión tiene como objetivo separar microorganismos contenidos en un pequeño volumen de muestra, distribuyendo las colonias resultantes uniformemente sobre la superficie del agar. Equilibre una placa a temperatura ambiente y etiquétela adecuadamente. Coloque la placa sobre la plataforma giratoria. Pipetee 0,1 mililitros de muestra en el centro del agar y cierre la tapa. Ejecte la punta en un recipiente de desecho. Sumerja la varilla metálica en un vaso de precipitados con etanol al 70 %, cubriendo toda la parte inferior del espátula y la primera pulgada del vástago, y luego escúrrala. Encienda el exceso de etanol pasándolo por la llama del mechero Bunsen. A continuación, abra la tapa de la placa de agar y enfríe el espátula tocándolo al agar en el borde, cerca del perímetro. Gire lentamente la plataforma. Sosteniendo suavemente el espátula sobre la superficie del agar, extienda gradualmente la muestra de forma uniforme sobre toda la placa usando un movimiento de ida y vuelta mientras la plataforma gira. Cierre la tapa y permita que la muestra se absorba completamente durante al menos cinco minutos. Luego, incube la placa invertida. Primero, etiquete adecuadamente la placa de agar. Abra la tapa de la placa de agar. Luego abra el recipiente de perlas de vidrio previamente esterilizadas y flamee el borde. Dispense cuidadosamente de 10 a 12 perlas de vidrio estériles sobre una placa de agar. Cierre la tapa de la placa y flamee el borde del recipiente de perlas de vidrio antes de colocar la tapa. Ahora, pipetee la muestra en el centro del agar. Con un movimiento horizontal, agite suavemente las perlas sobre la superficie del agar siete veces. Si se realiza correctamente, el procedimiento suena como si se estuvieran agitando maracas. Gire la placa 60 grados y agite horizontalmente nuevamente siete veces. Vuelva a girar la placa 60 grados y repita la agitación. Verifique que la muestra se haya absorbido. Luego, vierta las perlas contaminadas en un vaso colector marcado que contenga lejía al 10 %. Incube la placa invertida. El ensayo de placas se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar fagos bacterianos. Cultive la bacteria indicadora hasta la fase exponencial y guárdela en hielo. Luego, etiquete dos tubos microcentrífugos estériles como fago y control, y añada 50 microlitros de muestra de fago o tampón, respectivamente, a cada uno. A continuación, agite suavemente el cultivo bacteriano en el matraz, transfiera una alícuota de bacterias a un tubo estéril y vortex suavemente la bacteria indicadora; luego añada 500 microlitros de bacterias a cada tubo de absorción. Mezcle agitando suavemente los tubos con los dedos. Nunca vortex ni pipetee vigorosamente las muestras de fago. Incube la mezcla de bacterias y fago a la temperatura adecuada para la cepa indicadora durante 20 minutos. Mientras tanto, transfiera dos tubos de agar blando desde un baño de agua a 55 grados Celsius hasta un bloque calefactor a 48 grados Celsius. Equilibre durante 10 minutos. Etiquete dos placas de agar duro nutritivo sin condensación, previamente equilibradas a temperatura ambiente. Retire un tubo de agar blando del bloque térmico y verifique que el contenido no esté demasiado caliente al tacto. A continuación, transfiera asépticamente la mezcla desde el tubo de absorción de fago al tubo de agar blando. Luego, rote rápidamente entre las palmas para mezclar el contenido. Con el tubo en una mano, abra la tapa de la placa de agar duro con la otra. Inmediatamente vierta todo el contenido del tubo sobre la superficie de una placa de agar duro. Mueva suavemente la placa de un lado a otro. Cierre la tapa y coloque la placa sobre una superficie nivelada durante 30 minutos hasta que el agar blando se solidifique. A continuación, repita el procedimiento para el tubo de absorción de control, transfiriendo la mezcla de control a un tubo de agar blando. Mézclelo, viértalo sobre una placa de agar duro, muévalo suavemente y deje que el agar blando se solidifique durante 30 minutos. Inspeccione las placas en busca de formación de placas. Para aislar una placa a partir de una mezcla heterogénea, punce cuidadosamente el centro con un palillo estéril y transfiera el inóculo a un tubo microcentrífugo estéril que contenga 100 microlitros de tampón de fago. Continúe purificando este lisado repitiendo el ensayo de placas de tres a seis veces, con diluciones seriadas según sea necesario. El trasplante por replica explota un fenotipo seleccionable al permitir la comparación del crecimiento celular en una placa primaria con placas secundarias. Marque una cuadrícula en la base de la placa, etiquete la placa primaria y numere los cuadrados resultantes. Ahora, utilice una técnica aséptica para retirar un palillo previamente esterilizado del vaso, toque el centro de cada cuadrado con una muestra de células y deseche el palillo en un recipiente de desecho adecuado. Incube la placa primaria. Apile la placa primaria y todas las placas secundarias. Coloque una marca de orientación en el lateral de la mitad inferior de las placas. A continuación, retire un trozo de tela de terciopelo estéril de su envoltorio y colóquelo sobre el bloque cilíndrico. Luego, coloque el soporte alineando las marcas del soporte con las del bloque. Observe la marca de orientación en el bloque y el soporte. A continuación, retire la tapa de la placa primaria. Alinee las marcas de orientación de la placa y del bloque. Baje la placa para que la superficie del agar entre en contacto con la tela de terciopelo. Usando las yemas de los dedos, presione suavemente y uniformemente sobre la parte posterior de la placa primaria y luego levántela cuidadosamente del bloque. Confirme que la impresión de las células sea visible en el terciopelo. Vuelva a colocar la tapa en la placa. Ahora, repita secuencialmente el protocolo sobre la tela de terciopelo con cada una de las placas secundarias. Use la impresión de células del terciopelo de la placa primaria para inocular hasta ocho placas secundarias ordenadas desde el sustrato menos hasta el más favorable. Finalmente, como control positivo, para la última placa de la serie, use un medio de agar en el que todas las cepas probadas deberían crecer. Sujete las placas invertidas juntas con cinta adhesiva e incúbelas. Inspeccione las placas secundarias en busca de crecimiento. Apague el mechero Bunsen y guarde todos los materiales. Coloque la ropa de laboratorio contaminada, el material de vidrio y los residuos peligrosos en el recipiente de desecho adecuado. Limpie el área de trabajo con desinfectante. Finalmente, lávese las manos cuidadosamente con jabón antiséptico y agua tibia. Serratia Marcescens es una proteobacteria gramnegativa en forma de bastón que produce un pigmento rojizo llamado prodigiosina. Se encuentra comúnmente creciendo en baños y en cortinas de ducha. En este ejemplo, la técnica de siembra por estrías genera colonias individuales en el cuarto cuadrante. Este análisis de bacterias presentes en una muestra de agua recolectada de una fuente pública de agua potable utiliza la técnica de siembra por vertido. Observe la diferencia en la apariencia de las colonias. Las colonias superficiales son grandes y de forma circular, mientras que algunas colonias superficiales son muy pequeñas y de forma irregular. La técnica de siembra por extensión es un componente importante en experimentos de enriquecimiento, selección y cribado. Por ejemplo, el método copacabana es una herramienta diferenciadora en la prueba clásica azul-blanco en la tecnología del ADN recombinante. El fago T4 es un fago de ADN de doble cadena virulento que infecta a su huésped Escherichia coli, provocando la lisis y liberación de fagos progenie. Este ensayo de placas en agar EHA muestra fagos en zonas de claridad de aproximadamente un milímetro de diámetro. En ausencia de partículas de fago infecciosas, el crecimiento bacteriano resulta en una suspensión turbia de células en el agar blando, en la cual no son visibles colonias discretas. En la técnica de capa de agar blando, las morfologías de las placas varían. Por ejemplo, aquí la misma cepa de micobacteria produce morfologías de placas distintas en presencia de fagos destructores de micobacterias frente a fagos de micobacterias MSSS. El poder del trasplante por replica radica en el cribado simultáneo de un gran número de microorganismos. En este caso, se probaron cuatro cepas de Pseudomonas por duplicado para su crecimiento en tres fuentes de carbono diferentes: acetamida, lactosa y glicina. Aquí, la placa primaria es un medio YTA completo inoculado con las cuatro cepas según se indica. Las cepas muestran patrones de crecimiento variables en placas replica de medio mínimo MSA suplementado con una única fuente de carbono: acetamida, lactosa o glicina. Todas las cepas crecen en la última placa de control positivo, confirmando que las células se transfirieron a todas las placas secundarias en esta serie. La tabulación de estos resultados de placas replica detalla el cribado simultáneo de diferentes cepas silvestres para sus requerimientos característicos de crecimiento.— Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar procedimientos de siembra sin contaminar los medios ni las culturas, así como de cómo utilizar el método de siembra adecuado para cualquier tarea experimental dada en el laboratorio. Adquirir destreza en estas técnicas requiere práctica. Sin embargo, con una formación adecuada, los procedimientos de siembra descritos en este video se volverán naturales al trabajar en la mesa de laboratorio.

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Investigación

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