Name: La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a colocar bolas recubiertas con factores de crecimiento en embriones de pollo E2.5 mediante preparación in ovo. Este método permite estudiar la determinación del destino celular en biología del desarrollo.

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1. Eliminar los huevos de la incubadora En E2-2.5 (17 ~ San HH), quitar los huevos y preparar en consecuencia. Se puede trabajar de forma inmediata o devueltos a la incubadora durante un par de horas. Los huevos se pueden colocar de forma segura a temperatura ambiente por más de una hora. Los huevos pueden permanecer fuera de la duración de las manipulaciones. A veces, estos pueden tomar una hora o más. Nota: Cuanto más tiempo permanezcan a temperatura ambiente, es menos probable que puedan sobrevivir. 2. Preparación de la tinta china <ol><li> Prepare una solución fresca de un 4% de tinta India en PBS estéril. </li><li> Llene una jeringa de 3 ml con la solución. </li><li> Coloque una de calibre 27, una aguja de ½ pulgada en la jeringa. </li><li> Con un par de pinzas hemostáticas, doblar la aguja a un ángulo de 90 °. </li></ol> 3. La apertura de los huevos y la inyección de tinta china <ol><li> Con un par de pinzas, despegue la cinta y abrir la ventana, asegurándola con el reverso de la cinta en la parte posterior del huevo. </li><li> Guía de la aguja en ángulo hasta que se encuentra justo debajo del embrión. Colocar la aguja en el disco flotante asegura que la tinta, que es tóxico para el embrión, no entran en contacto directo. </li><li> Usted necesita sólo la inyección de tinta suficiente para crear un contraste confortable. Esto es típicamente menos de ¼ ml. </li></ol> 4. La apertura del tubo neural <ol><li> Tome un par de tijeras de disección fina y cortar la delgada membrana que se encuentra en la parte superior, oa veces todo el embrión. </li><li> Tome un par de pinzas de 55 o una sonda de tungsteno y abrir el tubo neural de posterior a anterior. Asegúrese de que la apertura es lo suficientemente grande como para colocar una gota en el mismo. </li></ol> Nota: Dependiendo de la edad, una sonda de tungsteno bien se puede utilizar para hacer la misma cosa. 5. Recuperación de un recubrimiento de heparina de cuentas de acrílico <ol><li> Con un par de pinzas de 55, encontrar una intacta cuenta en la solución. Deja que el cordón se adhiere a la punta, poco a poco cerrar la pinza. </li><li> Retire el cordón de la solución y ponerla en la parte superior del huevo. </li><li> Una vez que la cuenta está fuera de su solución, que probablemente no saldrá hasta que haya sido colocado en la albúmina. </li></ol> 6. La colocación de la bola <ol><li> Una vez que el talón se ha colocado en la parte superior de la zona de destino, utilice una sonda de tungsteno para guiarla hacia el cerebro anterior o arreglarlo en la parte posterior del cerebro. </li><li> Añadir unas gotas de PBS utilizando una pipeta de l 10. </li></ol> 7. Cierre del huevo <ol><li> Cerrar el huevo con la fina pieza de cinta adhesiva para cerrar la ventana. </li><li> Sello del huevo de acuerdo con el protocolo preparando, disponible en <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En función de la proteína que desea utilizar, hay diferentes protocolos sobre cómo preparar las cuentas. En estos experimentos, el uso de heparina-acrílico cuentas, pero afi-gel cuentas también se pueden utilizar. Hemos encontrado que las cuentas de la heparina de acrílico son más fáciles de manipular en el medio acuoso de la albúmina de huevo. Cuentas se sumergen en 5 l de proteínas durante la noche a 4 ° C. Cuentas de control se colocan en PBS estéril hasta el momento de la colocación. La ventaja de utilizar una preparación in ovo es que ...

<table><tbody><tr><td>Huevos</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Fertilizados, E2-2.5 (~ Est. 17 HH)</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinta de la India</td><td>Herramienta</td><td>Higgins</td><td></td><td>Preparar una solución al 4 % en PBS estéril.</td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternativamente, se puede usar un cóctel de anticuerpos</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas 27G 1/2</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Inclinadas a 90 grados</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Herramienta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>tamaño 55</td></tr><tr><td>Hemostatos</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Herramienta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Cinta de Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>para sellar los huevos</td></tr><tr><td>Pinza de tungsteno</td><td>Herramienta</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Herramienta n.º 24. El mango es opcional.</td></tr></tbody></table>

la colocación de crecimiento recubierto factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

El tubo neural se expresa muchas proteínas específicas en los patrones espacio-temporales durante el desarrollo. Estas proteínas se han demostrado ser fundamental para la determinación del destino celular, la migración celular y la formación de circuitos neuronales. Inducción neuronal y los patrones implican la proteína morfogenética ósea (BMP), Sonic hedgehog (SHH), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), entre otros. En particular, el patrón de expresión de Fgf8 se encuentra muy cerca de las regiones que expresan BMP4 y SHH. Este patrón de expresión es consistente con las interacciones que facilitan el desarrollo de patrones en el telencéfalo. A continuación presentamos una demostración visual de un método en el que una preparación ovo puede ser utilizado para probar los efectos de la FCF en la formación del cerebro anterior. Cuentas están recubiertas con proteínas y se coloca en el tubo neural en desarrollo para proporcionar una exposición sostenida. Debido a que el procedimiento se utiliza cuentas pequeñas, cuidadosamente colocados, que es mínimamente invasiva y permite varias cuentas para ser colocado dentro de un único tubo neural. Además, el método permite el desarrollo continuado de modo que los embriones pueden ser analizados en una etapa más madura para detectar cambios en la anatomía y en los patrones neuronales. Este protocolo simple pero útil permite obtener imágenes en tiempo real. Proporciona un medio para hacer los cambios espaciales y temporales se limita a los niveles de proteína endógena.

Una variedad de factores de crecimiento y proteínas interactúan para inducir a las células para asumir los destinos diferentes de células durante el desarrollo. Aquí se demuestra el uso de una preparación para hacer frente a ovo las posibles interacciones entre diferentes proteínas en el desarrollo mediante la colocación de las cuentas de E2.5 embriones de pollo.

La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

El tubo neural expresa numerosas proteínas siguiendo patrones espaciotemporales específicos durante el desarrollo. Se ha demostrado que estas proteínas son fundamentales para la célula...

Bienvenido al laboratorio Raburn. Soy Matt Korn, del departamento de Neurobiología y Conducta de la Universidad de California en Irvine. Hoy vamos a tomar un huevo, abrirlo y colocar una perla que ha sido sumergida en un factor de crecimiento.La maravillosa preparación de un huevo nos permitirá introducir un factor de crecimiento para cambiar el destino de varios tipos de tejidos en esta etapa temprana del desarrollo embrionario. Día dos y medio, o estadio 17. Bien, entonces estamos aquí, en el microscopio.Tengo mis huevos y todas mis herramientas. Así que adelante, tome un huevo aquí y podrá ver dónde está nuestra cinta. Sello de ventana.Tengo esta bonita donita pequeña. Está hecha simplemente de arcilla artística que se puede conseguir en una tienda de arte. Y voy a tomar un par de pinzas de cinco puntas realmente malas.Estos han existido durante mucho tiempo. Las puntas son bastante romas, pero funcionan muy bien para levantar la cinta lo suficiente como para que aparezca la ventana. Puedo colocarlos.Voy a doblar esto y colocar el huevo, esta ventana detrás, así. Ahora puedo colocarlo bajo el microscopio y realizar cualquier tipo de manipulación. En este caso, vamos a usar las c

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra dos métodos para la preparación y la colocación de cuentas, que han sido recubiertos con factor de crecimiento, en los explantes de la corteza cerebral en desarrollo. Estas cuentas pueden utilizarse para inducir la expresión de genes restricción espacial en el desarrollo del tejido neural, como explantes cerebro anterior. Métodos se dan para el uso de ambos Affi-Gel abalorios y cuentas de heparina Acryllic.

Factor de crecimiento-Coated colocación de bolas de explantes cerebro anterior dorsal

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

En este artículo se describe el etiquetado y la...

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Aquí divulgamos el etiquetado dual de las células de los nervios de la cresta y de los vasos sanguíneos usando el injerto intraespecies del tubo de los nervios del pollueloGFP combinado con la inyección intra-vascular de DiI. Esta técnica experimental nos permite visualizar y estudiar simultáneamente el desarrollo del sistema nervioso derivado de NCC (entérico) y del sistema vascular, durante la organogénesis.

Etiquetado Dual De Las Células De La Cresta Neural Y Los Vasos Sanguíneos Dentro De Los Embriones De Pollo Usando ChickGFP Injerto De Tubo Neural Y Carbocianina Tinte DiI Inyección

Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Se describen los protocolos que utilizan barreras impermeables para bloquear los eventos de inducción entre los tejidos del eje principal del cuerpo y el flanco en el embrión de pollo necesarios para la formación de las extremidades. Las perlas empapadas en señales inductivas candidatas se utilizan para superar el efecto de la colocación de barreras y el análisis de la expresión génica lo confirma.

La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

Aquí, presentamos una nueva técnica para cultivar embriones de pollo ex ovo para imágenes de lapso de tiempo utilizando luz transmitida y microscopía de fluorescencia. El sándwich de papel de filtro sumergido es una variante de la técnica de portador de papel de filtrobien establecida 1 que permite el cultivo de embriones de pollo completamente sumergidos en un medio de cultivo líquido.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones

En este método, los tejidos cardíacos embrionarios son quirúrgicamente microdissected, disociado, etiquetado fluorescente e implantado en los tejidos embrionarios de host. Esto proporciona una plataforma para el estudio de la organización del desarrollo nivel individuo o tejido bajo condiciones hemodinámicas ectópicas o alteración paracrina/yuxtacrina entornos.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

Aprende a colocar bolas recubiertas con factores de crecimiento en embriones de pollo E2.5 mediante preparación in ovo. Este método permite estudiar la determinación del destino celular en biología del desarrollo.

La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

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