Name: La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Aprende a medir la carga bacteriana y generar suspensiones celulares de hígado y bazo en ratones infectados con Listeria monocytogenes. Este método permite analizar respuestas inmunes mediante citometría de flujo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer a Anna Walduck, Cheers Christina, Berzins Stuart, Godfrey Dale, Zhan Yifan y Wilksch Jonathan para el asesoramiento y los reactivos. Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) y Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica (575552). NO es compatible con un premio de Postgrado en Australia. OW es apoyado por una beca de RD Wright de la Australian National Health Medical Research Council.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Listeria es uno de los organismos más ampliamente utilizados para caracterizar las respuestas inmunitarias del huésped frente a bacterias intracelulares6. El protocolo presentado aquí permite medir la carga bacteriana y las respuestas de las células inmunitarias dentro del mismo tejido de un ratón determinado. Esta doble medición en un tejido específico para cada ratón infectado permite comparaciones más robustas dentro y entre cohortes de ratones (ya sea que representen diferentes cepas de ratones o diferentes puntos temporales tras la infección). Aunque la infección por Listeria mediante administración oral también podría utilizarse para estudiar las respuestas inmunitarias en ratones, la infección mediante inyección intravenosa se emplea frecuentemente porque: 1) garantiza una entrega rápida y eficaz al torrente sanguíneo; 2) produce una infección sistémica sincronizada y constante; y 3) la especie Mus posee una mutación en el gen que codifica el receptor de E-cadherina, lo cual limita la infección por Listeria mediante administración oral (esta mutación afecta la capacidad de Listeria para unirse al receptor de E-cadherina del ratón y atravesar eficientemente el revestimiento epitelial del tracto gastrointestinal)16-18.
Existen varios pasos críticos en este protocolo. Primero, el stock del inóculo de Listeria debe generarse a partir de un cultivo fresco en HBA de crecimiento nocturno para asegurar la viabilidad y la virulencia. Segundo, es importante determinar con precisión la concentración de UFC del inóculo antes y después de inyectar a todos los ratones, para garantizar que la concentración de UFC no difiera significativamente entre el primer y el último ratón inyectado. Tercero, la inyección de Listeria en la vena de la cola debe ser consistente en todos los ratones. Por último, es necesario perfundir el hígado para agotar los leucocitos no residentes, lo que permitirá medir con precisión las células inmunitarias presentes en el hígado y no los leucocitos que circulan por la sangre periférica. Cualquiera de estos pasos, si no se realiza correctamente, puede generar variabilidad no deseada en la carga bacteriana y/o en las respuestas inmunitarias entre ratones individuales infectados con Listeria.
Dos limitaciones de este protocolo son la habilidad del investigador para infectar ratones mediante inyección intravenosa y la detección de la carga bacteriana en los tejidos. Si una persona inyecta un gran número de ratones, la viabilidad de Listeria (es decir, la concentración de UFC) puede disminuir con el tiempo una vez que el inóculo congelado se descongela (por ejemplo, &gt;2 horas entre la inyección del primer y del último ratón). Depende del investigador determinar cuántos ratones puede inyectar antes de que el inóculo se vea comprometido. Otra limitación de este método es que la carga de Listeria no puede medirse con precisión por debajo de 100 UFC/órgano debido a las cantidades relativamente pequeñas de homogenato de tejido cultivado (por ejemplo, la Figura 3 indica que 100 UFC/órgano es el límite de detección). Para medir con mayor precisión valores más bajos de UFC/órgano, se puede cultivar una cantidad mayor del homogenato de tejido (hasta 0,5 mL por placa, pudiéndose usar múltiples placas), de modo que se muestree una proporción mayor del tejido para la detección de Listeria. Si no se dispone de un Stomacher, pueden utilizarse métodos alternativos para homogeneizar el tejido, como un homogeneizador de tejidos, en los pasos 7.1-7.2. Desde un punto de vista práctico, si el espacio en la incubadora a 37 °C es limitado para el cultivo de muestras de tejido de ratones infectados, las placas de cultivo en HBA pueden incubarse a temperatura ambiente durante 2-3 días (las colonias crecerán más lentamente a temperatura ambiente). Sin embargo, no debe usarse la temperatura ambiente cuando se cultiven microorganismos para la preparación de stocks congelados de Listeria.
Este protocolo proporciona un enfoque básico para caracterizar la infección por Listeria en ratones y puede utilizarse con otras cepas de Listeria además de EGD. Además del hígado y el bazo, también se pueden obtener suspensiones de células individuales de los ganglios linfáticos. En cualquier caso, estas suspensiones de células individuales pueden emplearse para diversos análisis, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de células inmunitarias y la estimulación in vitro de células inmunitarias previamente clasificadas. Una vez dominadas las técnicas básicas, este protocolo también puede modificarse para aislar linfocitos T específicos para Listeria19, caracterizar células dendríticas20 o realizar la eliminación de células inmunitarias en momentos específicos tras la infección21,22, con el fin de caracterizar más exhaustivamente la respuesta inmunitaria en ratones infectados con Listeria.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Caballo de agar sangre base de N º 2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Preparación de la base de agar de placas HBA </td></tr><tr><td> La sangre de caballo (desfibrinada) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Añadir un 5-10% a base de agar </td></tr><tr><td> Infusión cerebro corazón (BHI) caldo (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Cerebral media de infusión de corazón deshidratado </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 pocillos de fondo plano </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 m de células colador </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeña placa de Petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster laboratorio de sistema de </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bolsas de plástico Stomacher </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón FACS </td><td></td><td></td><td> 0,1% (w / v) de albúmina sérica bovina en PBS </td></tr><tr><td> Percoll isotónico (33,75% Percoll en PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, PBS 1x 62.5mL hace 100 ml de Percoll isotónico </td></tr><tr><td> TAC Buffer </td><td></td><td></td><td> Tris 17 mm, 140 mm de cloruro de amonio en agua destilada </td></tr><tr><td> FCS / EDTA </td><td></td><td></td><td> Suero fetal bovino con 10 mM EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA </td><td></td><td></td><td> Tampón FACS + 5 mM EDTA </td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (w / v) en PBS, esterilizada por filtración </td></tr><tr><td> 2 ml criovial </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 jeringa de insulina gauge/1mL </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01T (1 ml), SS-053 (5 ml), SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

la medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) es un patógeno Gram-positivo intracelular facultativo 1. Los estudios en ratones suelen emplear la inyección intravenosa de Listeria, lo que resulta en una infección sistémica 2. Después de la inyección, Listeria difunde rápidamente en el bazo y el hígado debido a la absorción por CD8α + células dendríticas y las células de Kupffer 3,4. Una vez fagocitadas, diversas proteínas bacterianas permiten Listeria para escapar del fagosoma, sobrevivir en el citosol, e infectar a las células vecinas 5. Durante los tres primeros días de la infección, las diferentes células inmune innata (por ejemplo, los monocitos, neutrófilos, células NK, células dendríticas) intervienen en los mecanismos bactericidas que reducen al mínimo la proliferación de Listeria. Células T CD8 +, posteriormente reclutados y responsable de la liquidación final de Listeria desde el host, por lo general dentro de 10 días de la infección 6. Eliminación exitosa de Listeria a partir de ratones infectados depende de la aparición apropiada de las respuestas inmunitarias del huésped 6. Hay una amplia gama de sensibilidades entre las cepas de ratones endogámicos 7,8. En general, los ratones con una mayor susceptibilidad a la infección por Listeria son menos capaces de controlar la proliferación de bacterias, lo que demuestra aumento de la carga bacteriana y / o retraso en el aclaramiento en comparación con los ratones resistentes. Los estudios genéticos, incluidos los análisis de ligamiento y cepas knock-out mouse, se han identificado varios genes que la secuencia de variación afecta a las respuestas del huésped a la infección por Listeria 6,8-14. Determinación y comparación de la cinética de la infección entre las diferentes cepas de ratón es tanto un método importante para la identificación de factores genéticos que contribuyen a la respuesta inmune contra la listeria. La comparación de las respuestas del huésped a diferentes cepas de Listeria es también una forma efectiva de identificar los factores de virulencia de bacterias que pueden servir como blancos potenciales para la terapia con antibióticos o el diseño de vacunas. Se describe aquí un método sencillo para medir la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias [UFC] por tejido) y la preparación de una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de FACS análisis de la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria. Este método es especialmente útil para la caracterización inicial de la infección por Listeria en las cepas de ratón novela, así como la comparación de la respuesta inmune entre diferentes cepas de ratón infectado con Listeria. Usamos la Listeria monocytogenes EGD cepa 15 que, cuando se cultivaron en agar sangre, presenta una zona de halo alrededor de cada colonia característico debido a la β-hemólisis 1 (Figura 1). La carga bacteriana y la respuesta inmune se puede determinar en cualquier punto de tiempo después de la infección por el homogeneizado cultivo de tejidos en placas de agar sangre y la preparación de suspensiones de células de tejido para análisis FACS utilizando los protocolos descritos a continuación. Queremos hacer notar que las personas que están inmunocomprometidas o las mujeres embarazadas no deben manipular Listeria, y el correspondiente comité de bioseguridad institucional y manejo de los animales instalación debe ser consultado antes de comenzar el trabajo.

Listeria monocytogenes es un organismo modelo para estudiar la respuesta inmune y la susceptibilidad genética a las bacterias intracelulares en ratones. Este método permite medir la carga bacteriana y generar una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de los ratones para el análisis de FACS para determinar los cambios en las células inmunes, debido a la infección por Listeria.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

*Listeria monocytogenes* (Listeria) es un patógeno intracelular facultativo Gram positivo1. Los estudios en ratones emplean habitualmente la inyección intravenosa de...

Este video demuestra un método para medir la carga bacteriana y generar y analizar suspensiones de células individuales a partir del hígado y el bazo de ratones. Primero, se prepara un inóculo de listeria y se inyecta por vía intravenosa en ratones. Luego, se obtienen sangre, hígado y bazo de ratones sacrificados en puntos temporales seleccionados.Se preparan suspensiones de células individuales a partir de tejidos recolectados y homogenatos de tejidos AC cultivados en placas de agar sangre de caballo. Las suspensiones celulares resultantes pueden analizarse entonces por análisis de fax para viabilidad y contenido de células inmunitarias, mientras que la carga bacteriana se determina según unidades formadoras de colonias. Este método puede ayudar a caracterizar las respuestas inmunitarias frente a infecciones esteroides, como las existentes entre cepas mal susceptibles y resistentes, al tiempo que se determina simultáneamente la carga bacteriana en órganos infectados.Comience este procedimiento preparando el inóculo de listeria a la concentración deseada; las instrucciones para el cultivo, almacenamiento y preparación de listeria se encuentran en el protocolo escrito adjunto. Una vez que el inóculo esté listo, transfiera dos alícuotas de 100 microlitros a tubos microfusos estériles que contengan 900 microlitros de PBS para obtener una dilución uno a diez; luego transfiera 100 microlitros de cada dilución a placas de agar sangre de caballo (HBA) y extienda completamente con un espátula estéril para realizar el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC); a continuación, incube las placas invertidas a 37 grados Celsius durante la noche. A continuación, transfiera los ratones a una jaula limpia.Coloque la jaula a 50 centímetros bajo una lámpara infrarroja de 250 vatios durante cinco minutos para asegurar que la vena de la cola esté dilatada. Esto permite una mejor visualización durante la inyección. Aquí, el ratón resistente a listeria, la cepa C57 negro seis, y el ratón susceptible a listeria. La válvula C se inyectará mezclando suavemente la suspensión de listeria invirtiendo el tubo varias veces.Luego cargue una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27 para la inyección de 200 microlitros por ratón. Asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire presente en la jeringa antes de la inyección. Coloque al ratón en un dispositivo de inmovilización.Luego, localice la vena lateral de la cola del ratón identificando primero la arteria caudal, que se encuentra en la parte media del lado dorsal. A continuación, gire ligeramente la cola hacia el lado lateral para identificar la vena. Limpie suavemente la cola con una toallita de etanol al 70 % y luego inyecte tras retirar la jeringa.Aplique brevemente presión sobre la herida de entrada con un cuadrado de gasa estéril. Tenga en cuenta que es mucho más difícil identificar la vena de la cola en ratones de color negro tras la inyección. Devuelva el ratón a su jaula después de inyectar todas las placas de ratones e incube el inóculo restante para conteos de unidades formadoras de colonias.Como en el día anterior, cuente el número de colonias y determine las concentraciones del inóculo de listeria antes y después de la inyección. El halo característico que rodea a las colonias individuales, como se muestra aquí, se debe a la beta hemólisis. Una vez determinados los conteos antes y después de la inyección, calcule el promedio de unidades formadoras de colonias sumando los conteos de unidades formadoras de colonias antes y después de la inyección y dividiendo entre dos.Finalmente, en varios momentos posteriores a la inyección, recolecte sangre y extraiga el hígado y el bazo de los ratones sacrificados. Si se va a realizar un análisis de fax, el hígado debe perfundirse antes de su extracción para obtener sangre; realice una exsanguinación cardíaca inmediatamente después de la eutanasia y recoja toda la sangre posible en un tubo de recolección adecuado. Para perfundir el hígado, primero abra la cavidad abdominal y retire y deseche la vesícula biliar.La vena cava inferior es una vena que discurre paralela a la columna vertebral y transporta sangre desde la parte inferior del cuerpo, incluyendo el hígado, hacia el corazón. Utilizando un par de tijeras, seccione la vena justo por debajo del corazón para crear una salida por donde el fluido de perfusión pueda salir. A continuación, gire los lóbulos hepáticos hacia la cabeza y desplace los intestinos hacia la derecha para exponer la vena porta hepática, que conduce a la parte inferior del hígado.Desde la parte inferior derecha, inserte una aguja doblada de media pulgada y calibre 26 en la vena porta hepática e inyecte 10 mililitros de PBS. Después de inyectar uno o dos mililitros de PBS, el hígado cambiará de un color rojo oscuro a un marrón claro. La solución inyectada saldrá por la vena cava inferior seccionada. La perfusión hepática asegura que las células obtenidas provengan del hígado y no de la sangre circulante.A continuación, retire el hígado perfundido de la cavidad corporal del ratón y sumérjalo en el tubo con tampón facts sobre hielo. Luego retire el bazo y colóquelo sobre hielo para su procesamiento de manera similar a lo descrito en la siguiente sección. Para obtener suspensiones de células hepáticas individuales a partir del hígado, comience transfiriendo el hígado perfundido del tampón fax a un colador celular de 70 micrones colocado dentro de una placa de Petri de 60 milímetros.Utilizando el émbolo de una jeringa de cinco litros, empuje el tejido a través del filtro celular hacia la placa de Petri. Transfiera la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 50 mililitros con tapón roscado y aforar hasta un volumen total de 40 mililitros con tampón fax frío.Vortex la suspensión celular. Luego, separe un alícuota de un mililitro para la determinación de la carga bacteriana. Más adelante en el procedimiento, coloque el tubo de 50 mililitros en la centrífuga y haga un pellet de las células centrifugando a 500 × g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Después de desechar el sobrenadante, repita este paso de lavado resuspendiendo el precipitado en 40 mililitros de tampón fax frío y centrifugando. Nuevamente, resuspenda. Suspenda el precipitado en 20 mililitros de solución isotónica por pozo a temperatura ambiente y centrifugue la suspensión celular a 700 ×g durante 12 minutos a temperatura ambiente.Tras la centrifugación, una capa en forma de disco de hepatocitos flotará sobre el perol y los leucocitos quedarán sedimentados en el fondo del tubo; deseche la capa de hepatocitos y el perol vertiéndolos en un recipiente de desecho. A continuación, re suspenda el sedimento que contiene leucocitos en cuatro mililitros de tampón TAC para lisis de eritrocitos e incube las células a temperatura ambiente durante hasta 10 minutos con inversión frecuente. Tras la incubación, filtre la suspensión celular a través de una membrana de nailon de 100 micrones hacia un nuevo tubo cónico de 10 mililitros.Cubra la suspensión celular filtrada con un mililitro de tampón fax EDTA como se muestra aquí. Luego, centrifugue a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, resuspenda en cinco mililitros de tampón fax EDTA, luego centrifugue nuevamente y resuspenda el sedimento en 0,5 a tres mililitros de tampón fax EDTA, dependiendo del tamaño del sedimento. Determine el número de leucocitos hepáticos viables utilizando un hemocitómetro basado en la exclusión de azul de tripano en hígado.Las suspensiones de células individuales pueden entonces marcarse con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie celular deseados y analizarse mediante citometría de flujo. Una vez que se hayan obtenido suspensiones de células individuales a partir de tejidos de hígado y bazo, se determinarán las cargas bacterianas para partes del procedimiento. Se utilizará una máquina homogenizadora para homogenizar el tejido, manteniendo cerrada una bolsa de estómago ER para prevenir fugas.Comience colocándolo plano sobre una superficie limpia. Pase un bolígrafo redondo y grueso sobre el tejido hasta que quede triturado dentro de la bolsa. Añada cinco mililitros de PBS a cada bolsa de estómago que contenga tejido triturado.Coloque el estómago o las bolsas dentro del estómago y opere a alta velocidad durante 10 minutos. La máquina de estómago tiene dos paletas que presionan el estómago o las bolsas a una velocidad determinada, mezclando el contenido hasta obtener un homogeneizado uniforme y conteniendo cualquier aerosol. Con una pipeta, mezcle el homogeneizado en la bolsa. Luego transfiera 300 microlitros en duplicado a una placa de 96 pocillos con fondo plano.En los pocillos de la placa de 96 pocillos, realice una dilución serial de uno a 10 hasta una dilución de 10 a la cinco. Para cada muestra de homogenato de tejido, use cuidadosamente un asa estéril para distribuir 0,1 mililitros de cada dilución sobre una placa de HBA previamente secada. Incube las placas a 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, cuente el número de unidades formadoras de colonias para cada dilución y calcule las unidades formadoras de colonias por tejido, teniendo en cuenta los factores de dilución del tejido y el volumen del homogeneizado. Observe si ratones C57BL/6 fueron infectados con aproximadamente 2000 unidades formadoras de colonias de *Listeria* a los tres y siete días posteriores a la infección; los ratones fueron sacrificados y el hígado fue perfundido y extraído junto con el bazo. Se cultivaron diluciones del homogeneizado esplénico o de la suspensión de células individuales hepáticas en placas de HBA para determinar la carga bacteriana.En los resultados mostrados aquí, la línea punteada indica el límite de detección a 100 unidades formadoras de colonias por órgano. Tenga en cuenta que la carga de listeria es mayor al día tres que al día siete. Esto se debe a que, para el día siete, diversas células inmunitarias provocan la eliminación de listeria.En estos dos tejidos, bazo e hígado, las suspensiones de células individuales se tiñeron con azul de trian y se cargaron en un hemocitómetro. Las células dentro del área de conteo indicada en el cuadro rojo serán contadas. Las células no viables absorberán el azul de trian y aparecerán azules, mientras que las células viables permanecerán sin teñir.Como se muestra aquí, el número de células viables en el bazo mostrado a la izquierda y el número de leucocitos viables en el hígado mostrado a la derecha aumenta durante el transcurso de la infección. Este aumento se debe a células inmunitarias, incluidos neutrófilos y linfocitos, que se activan, proliferan y migran hacia estos dos sitios de infección. Como ejemplo de los niveles de células inmunitarias durante el transcurso de una infección por listeria, aquí se muestran gráficos de citometría representativos y el número de células T positivas para CD8.El número de linfocitos T CD8 positivos disminuye transitoriamente debido a la linfopenia en el bazo entre los días dos y tres, antes de aumentar notablemente a partir del día cinco tras la infección, tanto en el bazo como en el hígado. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la oscilación de andrógenos, linfocitos T específicos para antígenos y ensayos funcionales de células inmunitarias ordenadas, para caracterizar más a fondo las respuestas inmunitarias frente a la infección por listeria.

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Lo, B. C., et al. Fibrosis intestinal inducida por infección crónica por salmonela. J. Vis. Exp. (2019)El vídeo demuestra la cuantificación de la carga bacteriana en un modelo murino de infección crónica con Salmonella typhimurium resistente a estreptomicina. Tras la eutanasia y la disección estéril, se extraen tejidos cecales y esplénicos, se homogeneizan con perlas de acero para liberar bacterias y se diluyen en serie. Las diluciones se placan sobre agar selectivo y se cuentan las...

Cuantificación de la carga bacteriana tisular en un modelo murino de infección intestinal crónica

Fuente: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Evaluación de la invasión bacteriana de células cardíacas en cultivo y colonización cardíaca en ratones infectados usando Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo muestra la inyección de Listeria monocytogenes en la vena caudal de un ratón para establecer una infección sistémica. Muestra la circulación bacteriana, la colonización de órganos y la cuantificación de la carga bacteriana en el corazón mediante la homogeneización del tejido, la...

Cuantificación de la carga bacteriana en el corazón del ratón tras la inyección en la vena caudal de Listeria monocytogenes

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Este video muestra la cuantificación de la carga bacteriana infecciosa del cerebro de ratón perfundido infectado con Listeria monocytogenes.

Evaluación de la colonización bacteriana en el cerebro de un ratón después de una infección por Listeria monocytogenes

Este documento describe un nuevo método para la infección oral de ratones...

La transmisión oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En ratones a través de la ingestión de alimentos contaminados

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles.  Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio.  Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

Durante la infección, la Listeria monocytogenes es capaz de atravesar la barrera hemato - encefálica para colonizar el cerebro. En este protocolo, se demuestra cómo evaluar la colonización bacteriana de los órganos después de la infección de ratones. Se proporciona un procedimiento para realizar la perfusión de órganos enteros para determinación específica de números bacterianos en la parenquimia del cerebro.

Listeria monocytogenes Infección del cerebro

Se describen dos ensayos de infección in vitro e in vivo que pueden utilizarse para analizar las actividades de codificación de host factores.

Usando un patógeno bacteriano a punta de prueba para las respuestas celular y organísmica nivel Host

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Aprende a medir la carga bacteriana y generar suspensiones celulares de hígado y bazo en ratones infectados con Listeria monocytogenes. Este método permite analizar respuestas inmunes mediante citometría de flujo.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes

Explorar más videos