Name: Rata mesenterio ensayo angiogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Aprende a estudiar la angiogénesis de novo en tejido vascularizado adulto utilizando ventanas mesentéricas en ratas. Este método permite cuantificar la extensión espacial y la densidad de microvasos sanguíneos.

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Apoyo financiero para la mayoría de los estudios fue proporcionado por el Consejo Sueco de Investigación Médica (subvención 5942).

1. Los animales <ol><li> Pequeños roedores, como ratas, ratones y cobayas, se han utilizado como modelos animales. Por desgracia, los ratones adultos (muchas cepas de ratón han sido evaluados) tienden a carecer o tener sólo un número muy bajo de potencial de los padres microvasos (a partir de que la angiogénesis puede originar) dentro de sus ventanas mesentérica, lo que hace que los estudios con ratones confiable. Por lo tanto, el ensayo ha sido desarrollado principalmente para las ratas. </li><li> Las ratas, que están aclimatados a un medio ambiente normal durante al menos 7 días después de la entrega del criador, suelen alojarse en parejas en una jaula estándar en un 12 hr luz / oscuridad ciclo con acceso libre al agua y pellets. Cada animal está marcada. Utilizamos principalmente ratas adultas jóvenes (por lo general 7-10 semanas de edad de las distintas cepas, pero las ratas Sprague-Dawley, generalmente de sexo masculino, en las ratas más jóvenes de 5-6 semanas de edad el número de microvasos nativos tienden a ser bajos) obtenidos de diversos criadores. En el período anterior a la prueba y durante todo el experimento, se pesan los animales cada dos días, y siempre en el día del sacrificio. Cuando los animales son tratados de forma concurrente ip (para la inducción de la angiogénesis, ver abajo) y sc o iv o po, se pesan cada día. Esto permite el establecimiento de grupos experimentales y de control del peso corporal igual al comienzo del experimento, y permite el seguimiento de la influencia del tratamiento en el cuerpo, aumento de peso durante el transcurso del experimento. Dado que las ratas macho adultas creciendo sólidamente fisiológicamente (ganando aproximadamente 40 a 60 g por semana, dependiendo del tipo de cepa), la ganancia de peso retraso es un marcador sustituto sensibles de toxicidad, sistémica el bienestar, la anorexia, y la falta de desarrollo. </li></ol> Trabajamos en una instalación para animales de alto nivel de atención y un esfuerzo considerable para reducir al mínimo los niveles de estrés experimentado por los animales. Las directrices éticas actuales, son los establecidos por Workman P. et al. (Directrices para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer. Br. J. Cáncer 102, 1555-1577, 2010). El Comité de Ética Animal de la Universidad de Gotemburgo aprobó estos estudios. 2. Pro-angiogénicos tratamiento intraperitoneal <ol><li> El candidato pro-angiogénicos factor a ser probado se disuelve y se diluye en la endotoxina libre de solución salina utilizada para la perfusión de los pacientes (incluso en niveles extremadamente bajos, la endotoxina es pro-angiogénico). Todas las soluciones están formadas por recién en el día de la inyección, esterilizada por filtración (Millipore 0,22 micras de filtración), se verificó su pH neutro (7,1-7,3), y se utiliza a temperatura ambiente. El agente de prueba se inyecta en concentraciones bajas o muy bajas. Por ejemplo, la rata rVEGF 164 (564-RV/CF, R &amp; D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que es el VEGF-A isoforma predominante en ratas, se diluye a 96 pmol / ml de solución salina libre de endotoxinas, congelados y descongelado y un volumen de 5 ml se inyecta ip en la rata. Nosotros usamos una jeringa de 5 ml con aguja de 0,8 mm (aguja verde, 21G) para la inyección ip. Este tratamiento, dos veces al día durante 4,5 días, es decir., Desde la mañana del lunes (día 0) hasta la mañana del viernes (día 4), ​​induce una respuesta contundente al surgimiento de la angiogénesis en el tejido mesentérico prueba, alcanzando un máximo alrededor del día 21. La administración de la solución IP se asegura de que todo el volumen se entrega en la cavidad peritoneal (y no en los intestinos, la vejiga o cualquier otro órgano). La inyección rápida de 5 ml permite la confirmación táctil por el operador que el chorro de fluido ha pasado a través de la pared abdominal en la cavidad abdominal. Siguientes, antes o simultáneamente con la ip pro-angiogénicos tratamiento, cualquier agente de la prueba de elección puede administrar por vía sistémica. </li></ol> 3. Administación sistémica de la angiogénesis, la modulación de los agentes <ol><li> Cualquier otra vía que la vía IP se pueden utilizar, ya que el tratamiento ip puede afectar a la reacción en curso angiogénicos a través de la inducción de la inflamación o posiblemente por la activación de los mastocitos en el tejido de prueba, que puede conducir a un fuerte pro-angiogénicos respuesta. Además de la administración oral o inyección única subcutánea o intravenosa, a menudo utilizamos la administración subcutánea utilizando minibombas osmóticas (uno o más, con diferentes volúmenes de bombeo y los tiempos) para ofrecer la solución a una velocidad constante durante un máximo de dos o varias semanas. </li><li> Infusión subcutánea continua de los agentes de pruebas Llenado y la implantación de minibombas osmóticas Por lo general, el día 5, es decir, un día después del final del tratamiento con VEGF ip, minibombas osmóticas (por ejemplo, el modelo 2ML2, con velocidad constante bombeo de 5,0 l / h de 14 a 15 días; Alzet bombas osmóticas, Mountain View, CA , EE.UU.) se llenan en condiciones estériles con el agente de ensayo o el vehículo apropiado. Después de un almacenamiento en estéril al 0,9% (w / v) NaCl la noche a 37 ° C, la bomba (s) se implantan quirúrgicamente sc en la espalda (en el lado de la columna vertebral Column en la región de la escápula) de las ratas que han sido anestesiados con gas isoflurano (veterinario Isoba, Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EE.UU.), inicialmente en una cámara transparente y hermético Posteriormente, a través de una máscara (para minimizar el estrés causado al animal siguiente, la cámara se llena con aire antes de que se reutiliza). La incisión de la piel hecha para la implantación de la bomba se sutura inmediatamente después de la implantación del uso de hilo de seda. Puesto que los animales el aumento de peso fisiológicamente durante el período experimental y los agentes de prueba se administra a una velocidad constante, la dosis real seleccionado para una prueba de drogas por kg de peso corporal es superior a la dosis media al comienzo del período de infusión y es menor que la dosis media al final del periodo de perfusión. La infusión continua, como se describe aquí, puede ser visto como una forma extendida de tratamiento metronómica. </li></ol> 4. Poner fin a la experimentación <ol><li> Un animal a la vez que se coloca en una cámara hermética transparente, que se llena con gas CO2, que rápidamente se mata al animal. La cámara se purga con aire antes de ser utilizados de nuevo. </li></ol> 5. La recolección de muestras de tejido <ol><li> Como se muestra en el DVD, la pared abdominal se abre, y el mesenterio del intestino pequeño es identificado, incluyendo la parte más distal que llega a la válvula íleo-cecal (la unión del intestino delgado y el intestino grueso). Cuatro (o más) de los más distal localizado &quot;ventanas&quot; se numeran y se extendió hacia el objetivo estándar sin tratar Superfrost Plus diapositivas (Dako Denmark A / S, Glostrup, Dinamarca). Es importante evitar en lo posible, la contaminación de las muestras con contenido de sangre intestinal, u otros fluidos corporales, ya que estos materiales se pueden teñir de forma no específica, aunque esto no invalida la posterior visualización inmunohistoquímica de microvasos. </li><li> Cada muestra ventana mesentérica con el segmento de intestino delgado es adjunta extiende sobre un portaobjetos y se secan a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, el tronco intestinal se corta, mientras que las muestras intactas membranosa mesenterio se almacenan a -20 ° C durante períodos prolongados. Esto se muestra en el DVD. </li></ol> Cabe mencionar que la vascularización del tejido y las patentes se puede visualizar antes de la cosecha con la transmisión de microscopía intravital luz. 6. Protocolo para la tinción inmunohistoquímica de microvasos <ol><li> Día 0 Las muestras se dejan descongelar de -20 ° C a la temperatura ambiente, se seca en un armario a los 60 ° C durante 1 hora, y se mantiene a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Día 1 Colocar los portaobjetos en la tinción de los titulares de diapositivas (en cada segunda pista) en una cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,8) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solución se desecha y se sustituye por la siguiente solución, y así sucesivamente para todos los pasos siguientes. </li><li> Tripsina tratamiento Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con solución de tripsina (25 ° C durante 20 minutos). Deseche la solución e incubar dos veces con solución de sacarosa al 2,5% (a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez). Deseche la solución y aclarar un par de veces en agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos cada uno). </li><li> Bloqueo de Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con 0,5% de H 2 O 2 en metanol (temperatura ambiente durante 30 minutos). Deseche la solución y enjuagar con agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos). Deseche la solución y enjuagar dos veces con TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos cada vez). </li><li> Incubación Todas las incubaciones se encuentran en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Alrededor de 150 l de cada una de las soluciones que se indican a continuación se utilizan en cada diapositiva. Las diapositivas se colocan en una cámara húmeda y las soluciones son pipeta en las muestras (las partes no membranoso no tiene que ser cubierto por las soluciones). Para cada uno de los siguientes pasos, cuidadosamente deshacerse de toda la solución antes de que la solución posterior, se añade. <ol><li> Incubación con el normal (bloqueo) en suero (caballo) (ABC kit) 3 gotas de solución de color amarillo / 10 ml de tampón de dilución durante 20 minutos. </li><li> Incubación con el anticuerpo primario ARU0181, que las etiquetas de rata células endoteliales vasculares. El anticuerpo se diluye 1:600 ​​con tampón de dilución (Biosource) (100 l diluido 40 veces [congelado] más 900 l de tampón de dilución) y la incubación se lleva a cabo la noche a 4 ° C. </li></ol></li><li> Día 2 Las diapositivas se retiran de la cámara húmeda, el anticuerpo primario se descarta y las diapositivas se colocan en un portaobjetos de tinción, que se sumerge en la cubeta y se lavaron dos veces con TBS(PH 7,8) durante 8 minutos. <ol><li> La incubación con anticuerpos con biotina (ABC kit) Las diapositivas se colocan horizontalmente en una cámara húmeda y se incubaron con 1 gota de solución de azul / 10 ml de tampón de dilución durante 30 minutos. Deseche la solución y colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas tinción sumergido en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos. </li><li> La incubación con el reactivo ABC Las diapositivas de nuevo en posición horizontal en una cámara húmeda y las soluciones siguientes pipeta en la parte membranosa de las muestras: 2 gotas de solución de naranja y 2 gotas de solución de TBS marrón / 10 ml (pH 7,4) durante 30 minutos. Mezclar cuidadosamente 30 minutos antes de usar! Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos. </li></ol></li><li> La tinción con DAB (0,05%) Este paso debe realizarse en una campana de ventilación química! Coloque las diapositivas y añadir el 3,3-diaminobencidina (DAB, Sigma-Aldrich) solución con una pipeta: solución al 0,1% en TBS DAB (pH 7,4) [congelado] se diluye 1:1 con una mezcla de 10 l H 2 O 2 y 7,5 ml de TBS (pH 7,4). Esta solución es esterilizada por filtración antes de su uso (para eliminar cualquier partícula que pueda oscurecer la imagen microscópica). Tinción de las muestras durante 8 minutos. Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas manchas sumergidas en el tarro de las manchas. Enjuague con agua corriente y luego en agua destilada durante unos minutos. </li><li> Deshidratación Las diapositivas se mantienen en el soporte de diapositivas manchas. Enjuague por desechar y volver a llenar la jarra de tinción con agua destilada / etanol: agua destilada, alcohol al 70%, 95% de alcohol, alcohol absoluto, con 2 minutos en cada solución. </li></ol> 7. Imágenes y Evaluación de la red microvascular en cada muestra la ventana mesentérica Después de la tinción inmunohistoquímica de las células endoteliales vasculares Como se muestra en la película, los microvasos son microscópicamente visualizar in situ en el tejido intacto. <ol><li> En primer lugar, se utiliza un microscopio de dibujo con rango de aumento 14 a 34 (Leica M salvaje 3Z) a lápiz sobre papel blanco el área de la ventana entera, así como toda la zona vascularizada (VA) por la ventana mesentérica. VA, como porcentaje de toda el área, es fácil de medir mediante planimetría computerizada o no informáticos (o simplemente cortando y ponderación de la imagen de toda la ventana, y las imágenes de todas sus partes vascularizado). </li><li> El uso de otro microscopio de dibujo, los perfiles individuales de microvasos, que se identifican con facilidad, se dibujan en negro de tinta sobre papel blanco de 80 aumentos en los campos elegidos al azar. Este es el punto de partida para la posterior evaluación computarizada morfométrico de la longitud de complicaciones microvasculares (MVL), que es básicamente una medición de la densidad microvascular. </li><li> Opcionalmente, las variables relacionadas con la formación de patrones microvasculares, así como los de la evaluación del número de brotes microvascular y la longitud de cada uno de los brotes microvascular (N º SP y Le. SP, respectivamente) se puede determinar. -El contraste óptimo entre las estructuras de los vasos representado negro y el fondo blanco facilita el análisis detallado de las imágenes en la mayoría de los programas comerciales computarizados morfométricos. </li><li> En la mayoría de los casos, las variables más importantes son VA y MVL, que cuando se multiplica en conjunto generan la longitud total de microvasculares (TMVL). </li></ol> 8. Análisis estadístico Por lo general, utilizan el estándar no paramétrico de Mann-Whitney U-test para analizar impares (dos colas) observaciones. Un promedio de cuatro ventanas mesentérica por animal se utiliza como punto de datos independientes para cada variable de la ventana mesentérica. El criterio de significación estadística p ≤ 0,05.

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</ol>

El ensayo fue presentado en 1986 3 y sucesivamente ha sido desarrollado y perfeccionado en el laboratorio 7,10-12. Como se discutió en los documentos de revisión (invitado) 1, 2, el ensayo se compara bien con otros mamíferos en el ensayo de angiogénesis in vivo en lo que se refiere en particular a las características importantes tales como el tejido de la prueba para adultos es de forma nativa vascularizado y carece de la angiogénesis fisiológica, un traumatismo mínimo, en su caso, se infligidos a los tejidos, y las variables cuantitativas se miden realmente, lo que permite el análisis de estadística sólida relación dosis-respuesta y los estudios moleculares de actividad, la angiogénesis brote ocurre, que es predominante en los tejidos normales y tumores, y los datos de toxicidad se acumula fácilmente en las ratas que crecen robustamente fisiológicamente en la edad adulta. Características desfavorables pueden incluir el hecho de que el ensayo es relativamente lento, especialmente cuando se evalúa el número y la longitud de los segmentos individuales de microvasos y los brotes de microvasos, que no permite observaciones real-time/serial, y que no es adecuado para ratones ya que muchas ventanas mesentérica en ratones carecen de microvasos potenciales padres de nuevos capilares que se pueden originar. Observaciones en tiempo real, sin embargo, posible gracias a la microscopía intravital donde las ventanas mesentérica exteriorizado, pero intacta, son extendidas a lo largo de una platina del microscopio, mientras que el animal esté anestesiado, como se indica en 1. Avances significativos en la investigación de la angiogénesis se han logrado en las últimas décadas el uso de modelos como el micropocket la córnea, la membrana corioalantoidea de pollo, y sc ensayos plug Matrigel, que son herramientas útiles, pero limitado en última instancia. Futuras aplicaciones clínicas de terapias anti-angiogénicas y pro-angiogénicos requieren el establecimiento y validación de los más sensibles y relevantes biológicamente, verdaderamente cuantitativa modelos preclínicos, como la descrita en el informe actual.

Tampones y reactivos 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) solución madre Tris (hidroximetil) aminomethan (60,57 g) se disuelve en ~ 900 ml de agua destilada y ~ 45 ml de HCl 25% (concentrado) se agrega para alcanzar pH 7,8 seguido de dilución a 1 litro con agua destilada. Tris-buffer salino (TBS, pH 7,8) A 200 ml de la solución se añade 18 g de NaCl disuelto en ~ 1800 ml de agua destilada con el ajuste de pH a 7.8 con la solución madre, seguido de dilución de 2 litros con agua destilada. TBS (pH 7,4) A 200 ml de la solución se añade 18 g de NaCl disuelto en disolución en ~ 1800 ml de agua destilada con el ajuste de pH a 7.4 con la solución madre, seguido de dilución de 2 litros con agua destilada. Tripsina solución (0,05% de tripsina, el 0,1% CaCl 2) Contiene 0,1 g de tripsina y 0,2 g de CaCl2 en 200 ml de TBS (pH 7,8). Solución de sacarosa al 2,5% Contiene 5 g de sacarosa en 200 ml de TBS (pH 7,8). Solución madre de azida de sodio al 1% en TBS (pH 7,4) Contiene 1 g de Na-azida en 100 ml con TBS (pH 7,4). Dilución buffer: 0,1% de BSA, 0,01% de Na-azida (Se utiliza para diluir los anticuerpos en el kit Vectastain ABC). Contiene 0,1 g de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 ml de 1% de Na-azida, se diluye hasta 100 ml con TBS (pH 7,4). ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidasa IgG de ratón Suero normal de caballo, suero de bloqueo; solución de color amarillo: 3 drops/10 tampón de dilución. Biotinilado anticuerpo anti-IgG de ratón, solución de azul: 1 drop/10 tampón de dilución. ABC-reactivos: solución de naranja, 2 gotas de solución de color marrón, más 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4). Mezcla de estas soluciones 20 minutos antes de usar! Ratón (monoclonal) anti-rata endotelio (Biosource International, Camarillo, CA, EE.UU.) <table border="1"><tbody><tr><td> Catálogo # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clon # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Este anticuerpo está dirigido contra todas las células del endotelio vascular en la rata, con la excepción de aquellos en el cerebro. Vectastain peroxidasa avidina biotina (ABC) kit El kit contiene anticuerpos primaria, secundaria de anticuerpos con biotina, avidina-biotina complejo enzimático (ABC), y el sustrato de la enzima. Ver <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> o <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> para los protocolos. Albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich, catálogo # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobencidina Isopac (Sigma-Aldrich, catálogo # D 9015). Tripsina de páncreas bovino (Sigma-Aldrich, catálogo # T 4665). Peroxidasa Vectastain ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Suecia)

rata mesenterio ensayo angiogénesis

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

El mesenterio rata adulta ventana de ensayo de la angiogénesis es biológicamente adecuado y está excepcionalmente bien adaptado para el estudio de brotes angiogénesis in vivo [ver artículos de revisión], que es la forma dominante de la angiogénesis en los tumores y tejidos humanos no tumorales, como se discutió en la revisión de invitados artículos 1,2. Angiogénesis inducida en las partes mesentérica membranosa por vía intraperitoneal (ip) la inyección de un factor pro-angiogénico puede ser modulada por vía subcutánea (sc), por vía intravenosa (iv) u oral (po) el tratamiento con agentes modificadores de la elección. Cada parte membranosa del mesenterio es transparente y enmarcado por el tejido adiposo, dándole una apariencia similar a la ventana. El ensayo tiene las características ventajosas siguientes: (i) el tejido vascularizado prueba de forma nativa, aunque poco, y ya que es muy delgada, la red de microvasos es prácticamente bidimensional, que permite a toda la red para ser evaluados microscópicamente in situ; ( ii) en ratas adultas del tejido prueba carece de la angiogénesis fisiológica importante, que caracteriza a la mayoría de los tejidos normales de los mamíferos adultos, el grado de vascularización materna es, sin embargo, en correlación con la edad, como se discutió en una, (iii) el nivel insignificante de la angiogénesis inducida por el trauma asegura una alta sensibilidad, (iv) el ensayo reproduce la situación clínica, como los medicamentos de prueba de la angiogénesis modulación se administran por vía sistémica y las respuestas observadas reflejan el efecto neto de todos los metabólicos, celulares y alteraciones moleculares inducidos por el tratamiento; (v) el ensayo permite la evaluación de los objetivos, las variables cuantitativas, sin prejuicios de la extensión espacial microvascular, la densidad y la formación de patrones de la red, así como de brotes capilares, lo que permite robusto análisis estadísticos de la relación dosis-efecto y molecular relaciones estructura-actividad, y (vi ) el ensayo pone de manifiesto con una alta sensibilidad a los efectos tóxicos o perjudiciales de los tratamientos en términos de disminución de la tasa fisiológica del peso corporal, como las ratas adultas creciendo sólidamente. Mastocitos mediada por la angiogénesis se demostró por primera vez utilizando este ensayo 3,4. El modelo muestra un alto nivel de discriminación respecto a los efectos de dosis-relaciones y los efectos medidos de la administración sistémica de química ni funcionalmente medicamentos estrechamente relacionados y las proteínas, incluyendo: (i) de baja dosis, administrada metronomically quimioterapéuticos estándares que producen diversos efectos específicos de drogas (es decir, las actividades de la angiogénesis-supresores, neutral o estimular la angiogénesis-5), (ii) naturales de hierro-insaturados lactoferrina humana, que estimula el VEGF-A la angiogénesis mediada por 6, y natural de hierro-insaturados lactoferrina bovina, lo que inhibe el VEGF-A- angiogénesis mediada por 7, y (iii) de bajo peso molecular fracciones de heparina producida por diversos medios 8,9. Por otra parte, el ensayo resulta muy adecuado para los estudios de los efectos combinados de la angiogénesis de los agentes que se administran por vía sistémica en forma simultánea o secuencial. La idea de hacer este video se originó a partir de finales de los años el doctor Judah Folkman, cuando visitó nuestro laboratorio y fue testigo de la metodología que se ha demostrado. Revisión de los documentos (invitado) discutir y evaluar el ensayo Norrby, K. En los modelos in vivo de la angiogénesis. J. Cell. Mol. Medicina 10, 588-612 (2006). Norrby, las pruebas con modelos K. Drogas angiogénesis. Opin experto. De drogas. Descubrimiento. 3, 533 a 549 (2008).

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

El ensayo de angiogénesis en la ventana del mesenterio de rata adulta es biológicamente apropiado y es excepcionalmente adecuado para el estudio de la angiogénesis por brotación en...

Bienvenido al Departamento de Patología del Hospital Universitario GaN en Guttenburg, Suecia. Soy el Dr. Klaus Norby, y el método que está a punto de ver fue desarrollado en mi laboratorio. La angiogénesis clínicamente relevante, que ocurre en conexión con hipoxia, tumores sólidos o cualquier otra enfermedad angiogénica, tiene lugar casi exclusivamente en tejido vascularizado de forma nativa. En roedores pequeños adultos, el mesenterio, que conecta el intestino delgado con la pared posterior del cuerpo, contiene varias partes delgadas y membranosas. En ratas, existen aproximadamente entre 40 y 50 de estas ventanas mesentéricas. Son prácticamente transparentes y, por tanto, similares a ventanas a simple vista; cada ventana está rodeada por tejido adiposo en ratas macho adultas.Las ventanas mesent&eacute;ricas est&aacute;n vascularizadas de forma natural y carecen de angiog&eacute;nesis fisiol&oacute;gica medible. Por lo tanto, ofrecen la oportunidad de estudiar la angiog&eacute;nesis de novo en tejido mam&iacute;fero adulto nativamente vascularizado. Es decir, el inicio de una respuesta angiog&eacute;nica completa desde cero, superando los inhibidores de la angiog&eacute;nesis que act&uacute;an de forma end&oacute;gena en el tejido de prueba, como ocurre en todos los tejidos normales en ratones. Los microvasos nativos que pueden actuar como microvasos parentales est&aacute;n ausentes en muchas ventanas, lo que desafortunadamente hace que el ensayo sea impredecible en ratones en su forma nativa.Las ventanas mesent&eacute;ricas en ratas normalmente contienen una cantidad relativamente peque&ntilde;a de peque&ntilde;os vasos sangu&iacute;neos ubicados en la periferia en ratas adultas. Estas ventanas mesent&eacute;ricas tienen naturalmente un grosor de solo entre cinco y diez micr&oacute;metros. Esto permite extender el tejido intacto sobre portaobjetos y observarlo microsc&oacute;picamente, lo que posibilita visualizar todos los vasos en cada ventana y otorgar a los vasos una extensi&oacute;n esencialmente bidimensional.El método ofrece una oportunidad sin igual para realizar mediciones cuantitativas de la extensión espacial, densidad, formación de patrones y tamaño de los microvasos sanguíneos. El sitio subcutáneo es popular para estudios de angiogénesis; sin embargo, debido a la heterogeneidad de las células endoteliales y las propiedades específicas del tejido, el control de la angiogénesis en tejidos subcutáneos y tumores que crecen subcutáneamente puede no predecir el control de la angiogénesis en órganos viscerales metastásicos como el pulmón, hígado, hueso y cerebro. Esto es destacable ya que las metástasis viscerales generalmente son las responsables últimas de la letalidad del cáncer.El hecho de que la ventana mesentérica sea visceral debería ser ventajoso en este sentido. El objetivo de nuestro proyecto es estudiar cuantitativamente aspectos de la angiogénesis de novo. Por lo tanto, inyectamos un factor proangiogénico establecido o una sustancia de prueba por vía intraperitoneal.Normalmente inyectamos cinco mililitros a la vez en ratas adultas no anestesiadas. Un volumen de este tipo expone rápidamente todo el mesenterio al líquido inyectado. Cualquier solución inyectada por vía intraperitoneal, siempre que su volumen no sea diminuto, debería afectar a todas las células del tejido analizado, especialmente porque la capa mesotelial de células que recubre la ventana mesentérica extremadamente delgada es altamente permeable a los solutos. Como no se requiere cirugía, la angiogénesis que se estudia en la ventana mesentérica no se ve afectada por la angiogénesis inducida por cicatrización de heridas; por lo tanto, el tratamiento angiogénico se administra en forma de inyecciones intraperitoneales.Por razones prácticas, utilizamos un protocolo de tratamiento que comprende dos inyecciones diarias durante un período de cinco días, desde el lunes por la mañana hasta el viernes por la mañana, como es estándar al estudiar los efectos angiogénicos de proteínas definidas como VEGF 1 65, 1 64 y FGF básico, por ejemplo. Habitualmente se utiliza la solución de infusión de Pharmacia como vehículo. El número de tratamientos puede parecer elevado, pero se ha demostrado que no siempre es posible inducir una angiogénesis estadísticamente significativa incluso al usar factores proangiogénicos tan potentes como VEGF y FGF básico cuando se administran a niveles aproximadamente fisiológicos en una sola dosis o en pocas dosis espaciadas; debe recordarse que en el tejido operan potentes inhibidores endógenos de la angiogénesis.La administración de modalidades terapéuticas que modulan la angiogénesis imita una situación terapéutica clínica. Se puede administrar uno o más factores que modulan la angiogénesis por vía sistémica, subcutánea, intravenosa u oral. Por ejemplo.Esto simula una situación de tratamiento clínico, ya que se puede estudiar el efecto no solo de la molécula original, sino también de sus metabolitos. El sistema permite cierto grado de control sobre los efectos tóxicos de los agentes moduladores de la angiogénesis administrados sistémicamente. Dado que las ratas adultas crecen fisiológicamente y pueden aumentar su peso en aproximadamente un 40 % durante un experimento de dos o tres semanas, es posible, mediante la pesada de los animales, evaluar en qué medida el tratamiento ha ralentizado el aumento de peso corporal, lo cual puede considerarse un indicador de los efectos tóxicos.Esto permite evitar dosis tóxicas de sustancias en pruebas de modulación de la angiogénesis. Un beneficio importante, ya que podría ser imposible interpretar los resultados en términos de efectos antiangiogénicos específicos si se ha producido un efecto tóxico. Dado que las ratas adultas crecen considerablemente más rápido que los ratones adultos, el efecto de agentes tóxicos sobre la ganancia de peso corporal debería ser un indicador más sensible de efectos tóxicos generales en ratas que en ratones.Ahora nos gustaría mostrarle cómo se preparan las muestras de ventana mesentérica. Estos animales fueron sacrificados utilizando CO2. Las ventanas mesentéricas se extienden sobre portaobjetos comunes más de tres por una pulgada, comenzando distalmente en el mesenterio.La angiogénesis no se puede observar a simple vista en la ventana mesentérica, comenzando desde la válvula ileocecal y avanzando en dirección retrógrada. Se utilizan las cuatro ventanas obtenidas de la parte más distal del mesenterio. La muestra sobre el portaobjetos se seca a temperatura ambiente durante 20 minutos.Se secciona el muñón intestinal. Luego, los especímenes se conservan en un congelador a menos 20 grados centígrados. De este modo, los especímenes pueden mantenerse durante varios meses, quizás incluso años, sin que se produzca una deterioración pronunciada en la calidad.La tinción se realiza utilizando un anticuerpo monoclonal contra el endotelio de rata; permita que la muestra se seque al aire, no monte con un cubreobjetos. La cuantificación de los incidentes de vasos sanguíneos en ventanas mesentéricas individuales se realiza mediante microscopía morfométrica asistida por computadora, utilizando un microscopio de dibujo con un aumento óptico total entre 14 y 34. Se visualiza completamente la ventana mesentérica.El aumento se elige en pasos fijos de modo que la mayor parte posible del campo de visión esté cubierta por la muestra. Toda el área de la ventana se representa fácilmente, ya que el límite entre la ventana y el tejido adiposo circundante es nítido. A continuación, todas las partes vascularizadas se dibujan según criterios cuidadosamente definidos.Incluso los vasos sanguíneos recién formados más pequeños, cuyo diámetro a aumentos más altos se ha encontrado que es de aproximadamente 2,5 a 3,0 micrómetros, pueden distinguirse claramente. El hecho de que el diámetro medio de los eritrocitos de rata sea igual o mayor a 6,3 micrómetros muestra lo pequeños que son estos vasos. El área de todas las partes vascularizadas en una ventana como porcentaje del área de toda la ventana se conoce como el área vascularizada relativa va.Es, a todos los efectos, una medición de la extensión espacial de los vasos, ya que tienen esencialmente una extensión bidimensional; la VA se puede medir fácilmente mediante telemetría asistida por computadora, por ejemplo. El siguiente paso consiste en registrar la densidad de los microvasos y la formación de patrones dentro de tres partes centrales de las áreas vascularizadas de cada ventana. Estas partes se eligen sistemáticamente al azar con un aumento óptico de 80.Cada vaso se visualiza como una sola línea utilizando un microscopio de dibujo. La imagen de cada campo de visión se transfiere a una imagen digitalizada y a un analizador de imágenes, y luego cada vaso en la imagen digitalizada se reduce a un grosor de un píxel. La máquina mide entonces el número de píxeles, que representa los vasos y se expresa como una fracción de todos los píxeles en el campo de visión.Esta cifra porcentual, la longitud microvascular o MVL, representa la longitud de los microvasos en cada unidad del área vascularizada y es una medida compuesta de la densidad de microvasos. Al multiplicar el valor promedio de VA de cuatro ventanas por animal por el valor medio de MVL del grupo de tratamiento correspondiente, se calcula la longitud total de microvasos por animal, o TMVL. Además, hemos desarrollado técnicas para el análisis cuantitativo detallado de la densidad y composición de microvasos mediante análisis de imágenes.Estos incluyen la medición de la distancia real entre dos microvasos sucesivos, puntos de ramificación, IE, la longitud de microvasos individuales, segmentos LEMS, el número de microvasos, segmentos por unidad de volumen de tejido, NOMS, y el número de puntos de ramificación de microvasos por unidad de volumen de tejido, NOBP. El grado de tortuosidad en los microvasos, MVT, se determina por la diferencia entre la distancia más corta y la distancia real entre dos puntos de ramificación sucesivos, la presencia de microvasos que se cruzan, el índice de intersección INIS, y la formación de bucles interconectados. El índice de formación de bucles, INLF, también puede medirse con precisión mediante técnicas similares en la periferia de la red de microvasos.También podemos cuantificar variables correspondientes para brotes, incluyendo la longitud de los brotes, LESP, y el número de brotes por unidad de volumen tisular, NOSP, diseñando ensayos dado que pueden existir diferencias significativas entre animales dentro del mismo grupo de tratamiento e incluso entre ventanas mesentéricas en un mismo animal. Hemos encontrado que el siguiente diseño puede resultar práctico: el número de animales por grupo de tratamiento durante el período de observación, de ocho a doce; el número de ventanas por animal que se analizan en términos de VA; el número de campos de visión por cada ventana que se analizan en términos de longitud microvascular, MVL; longitud de los microvasos, segmentos, LEMS; número de segmentos de microvasos, NOMS; número de puntos de ramificación de microvasos, NOBP; tortuosidad de los microvasos, MVT; índice de intersección, I; índice de formación de bucles, INF. Se utilizan tres animales tratados con vehículo como controles. El ensayo de angiogénesis en la ventana mesentérica es especialmente adecuado para estudios de efecto dosis-respuesta y para análisis cinéticos de la angiogénesis.Esto puede realizarse tratando grupos de animales con diferentes dosis de un factor proangiogénico y sacrificando estos animales en diferentes puntos temporales durante la respuesta angiogénica. De este modo, puede discernirse en términos cuantitativos la fase expansiva, el pico y la subsiguiente fase angiorregresiva. Estudios de este tipo han revelado que la respuesta angiogénica de novo a cualquier citocina factor de crecimiento ensayada es específicamente dependiente de la dosis en cuanto a velocidad, potencia y duración.Además, el patrón de los nuevos vasos en cuanto a la extensión espacial y los cambios en los microvasos, la densidad suele ser marcadamente dependiente de la dosis y del tiempo en comparación con la angiogénesis mediada por VEGF o FGF básico a dosis aproximadamente fisiológicas. La angiogénesis mediada por mastocitos, MCMA inducida mediante la activación selectiva de mastocitos in situ, presenta una potencia considerablemente mayor y una duración notablemente más prolongada. De hecho, la angiogénesis mediada por mastocitos fue descrita por primera vez utilizando este ensayo debido a la capacidad de cuantificar variables objetivas de angiogénesis, al alto grado de relevancia biológica del sistema y a la posibilidad de verificar tratamientos tóxicos.La metodología es especialmente adecuada para los análisis de estructura-actividad y de respuesta a la dosis. El ensayo MWAA en ratas incluye un modelo para estudiar la angiogénesis en un tejido visceral vascularizado de forma nativa en adultos que carece de angiogénesis fisiológica y que no se ve afectado por cirugía, excluyendo así cualquier influencia de la angiogénesis inducida por cicatrización. El ensayo es verdaderamente cuantitativo y evalúa con precisión varias variables objetivas biológicamente relevantes que describen la extensión espacial, la densidad y la formación de patrones de los microvasos.El ensayo es muy adecuado para estudiar los efectos sistémicos de la angiogénesis, los factores moduladores, así como para investigaciones sobre la relación estructura-actividad y la respuesta a la dosis. La metodología descrita aquí ha sido desarrollada en el laboratorio del Dr. Kloss Carl Norby, del Departamento de Patología, del Hospital Universitario Reka, Universidad Jute Borg de Gotemburgo en Suecia. Todos los estudios de este proyecto han sido financiados por el Consejo Sueco de Investigación Médica, número de proyecto 5 9 4 2.Se agradece la hábil asistencia técnica de la Sra. Gun Effer, quien ha participado desde el inicio del proyecto, de la Sra. Monica Anderson, no presente, y de la Sra. Ann Nemar Lindgren.Espero que esta breve presentación le haya dado una idea del potencial del ensayo. Si utiliza este ensayo en su laboratorio, estaré encantado de ayudarle si encuentra algún problema técnico. Asimismo, agradecería mucho cualquier sugerencia que pudiera tener.Gracias.

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Rata mesenterio ensayo angiogénesis

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