Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Bienvenido al Departamento de Patología del Hospital Universitario GaN en Guttenburg, Suecia. Soy el Dr. Klaus Norby, y el método que está a punto de ver fue desarrollado en mi laboratorio. La angiogénesis clínicamente relevante, que ocurre en conexión con hipoxia, tumores sólidos o cualquier otra enfermedad angiogénica, tiene lugar casi exclusivamente en tejido vascularizado de forma nativa. En roedores pequeños adultos, el mesenterio, que conecta el intestino delgado con la pared posterior del cuerpo, contiene varias partes delgadas y membranosas. En ratas, existen aproximadamente entre 40 y 50 de estas ventanas mesentéricas. Son prácticamente transparentes y, por tanto, similares a ventanas a simple vista; cada ventana está rodeada por tejido adiposo en ratas macho adultas.

Las ventanas mesentéricas están vascularizadas de forma natural y carecen de angiogénesis fisiológica medible. Por lo tanto, ofrecen la oportunidad de estudiar la angiogénesis de novo en tejido mamífero adulto nativamente vascularizado. Es decir, el inicio de una respuesta angiogénica completa desde cero, superando los inhibidores de la angiogénesis que actúan de forma endógena en el tejido de prueba, como ocurre en todos los tejidos normales en ratones. Los microvasos nativos que pueden actuar como microvasos parentales están ausentes en muchas ventanas, lo que desafortunadamente hace que el ensayo sea impredecible en ratones en su forma nativa.

Las ventanas mesentéricas en ratas normalmente contienen una cantidad relativamente pequeña de pequeños vasos sanguíneos ubicados en la periferia en ratas adultas. Estas ventanas mesentéricas tienen naturalmente un grosor de solo entre cinco y diez micrómetros. Esto permite extender el tejido intacto sobre portaobjetos y observarlo microscópicamente, lo que posibilita visualizar todos los vasos en cada ventana y otorgar a los vasos una extensión esencialmente bidimensional.

El método ofrece una oportunidad sin igual para realizar mediciones cuantitativas de la extensión espacial, densidad, formación de patrones y tamaño de los microvasos sanguíneos. El sitio subcutáneo es popular para estudios de angiogénesis; sin embargo, debido a la heterogeneidad de las células endoteliales y las propiedades específicas del tejido, el control de la angiogénesis en tejidos subcutáneos y tumores que crecen subcutáneamente puede no predecir el control de la angiogénesis en órganos viscerales metastásicos como el pulmón, hígado, hueso y cerebro. Esto es destacable ya que las metástasis viscerales generalmente son las responsables últimas de la letalidad del cáncer.

El hecho de que la ventana mesentérica sea visceral debería ser ventajoso en este sentido. El objetivo de nuestro proyecto es estudiar cuantitativamente aspectos de la angiogénesis de novo. Por lo tanto, inyectamos un factor proangiogénico establecido o una sustancia de prueba por vía intraperitoneal.

Normalmente inyectamos cinco mililitros a la vez en ratas adultas no anestesiadas. Un volumen de este tipo expone rápidamente todo el mesenterio al líquido inyectado. Cualquier solución inyectada por vía intraperitoneal, siempre que su volumen no sea diminuto, debería afectar a todas las células del tejido analizado, especialmente porque la capa mesotelial de células que recubre la ventana mesentérica extremadamente delgada es altamente permeable a los solutos. Como no se requiere cirugía, la angiogénesis que se estudia en la ventana mesentérica no se ve afectada por la angiogénesis inducida por cicatrización de heridas; por lo tanto, el tratamiento angiogénico se administra en forma de inyecciones intraperitoneales.

Por razones prácticas, utilizamos un protocolo de tratamiento que comprende dos inyecciones diarias durante un período de cinco días, desde el lunes por la mañana hasta el viernes por la mañana, como es estándar al estudiar los efectos angiogénicos de proteínas definidas como VEGF 1 65, 1 64 y FGF básico, por ejemplo. Habitualmente se utiliza la solución de infusión de Pharmacia como vehículo. El número de tratamientos puede parecer elevado, pero se ha demostrado que no siempre es posible inducir una angiogénesis estadísticamente significativa incluso al usar factores proangiogénicos tan potentes como VEGF y FGF básico cuando se administran a niveles aproximadamente fisiológicos en una sola dosis o en pocas dosis espaciadas; debe recordarse que en el tejido operan potentes inhibidores endógenos de la angiogénesis.

La administración de modalidades terapéuticas que modulan la angiogénesis imita una situación terapéutica clínica. Se puede administrar uno o más factores que modulan la angiogénesis por vía sistémica, subcutánea, intravenosa u oral. Por ejemplo.

Esto simula una situación de tratamiento clínico, ya que se puede estudiar el efecto no solo de la molécula original, sino también de sus metabolitos. El sistema permite cierto grado de control sobre los efectos tóxicos de los agentes moduladores de la angiogénesis administrados sistémicamente. Dado que las ratas adultas crecen fisiológicamente y pueden aumentar su peso en aproximadamente un 40 % durante un experimento de dos o tres semanas, es posible, mediante la pesada de los animales, evaluar en qué medida el tratamiento ha ralentizado el aumento de peso corporal, lo cual puede considerarse un indicador de los efectos tóxicos.

Esto permite evitar dosis tóxicas de sustancias en pruebas de modulación de la angiogénesis. Un beneficio importante, ya que podría ser imposible interpretar los resultados en términos de efectos antiangiogénicos específicos si se ha producido un efecto tóxico. Dado que las ratas adultas crecen considerablemente más rápido que los ratones adultos, el efecto de agentes tóxicos sobre la ganancia de peso corporal debería ser un indicador más sensible de efectos tóxicos generales en ratas que en ratones.

Ahora nos gustaría mostrarle cómo se preparan las muestras de ventana mesentérica. Estos animales fueron sacrificados utilizando CO2. Las ventanas mesentéricas se extienden sobre portaobjetos comunes más de tres por una pulgada, comenzando distalmente en el mesenterio.

La angiogénesis no se puede observar a simple vista en la ventana mesentérica, comenzando desde la válvula ileocecal y avanzando en dirección retrógrada. Se utilizan las cuatro ventanas obtenidas de la parte más distal del mesenterio. La muestra sobre el portaobjetos se seca a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Se secciona el muñón intestinal. Luego, los especímenes se conservan en un congelador a menos 20 grados centígrados. De este modo, los especímenes pueden mantenerse durante varios meses, quizás incluso años, sin que se produzca una deterioración pronunciada en la calidad.

La tinción se realiza utilizando un anticuerpo monoclonal contra el endotelio de rata; permita que la muestra se seque al aire, no monte con un cubreobjetos. La cuantificación de los incidentes de vasos sanguíneos en ventanas mesentéricas individuales se realiza mediante microscopía morfométrica asistida por computadora, utilizando un microscopio de dibujo con un aumento óptico total entre 14 y 34. Se visualiza completamente la ventana mesentérica.

El aumento se elige en pasos fijos de modo que la mayor parte posible del campo de visión esté cubierta por la muestra. Toda el área de la ventana se representa fácilmente, ya que el límite entre la ventana y el tejido adiposo circundante es nítido. A continuación, todas las partes vascularizadas se dibujan según criterios cuidadosamente definidos.

Incluso los vasos sanguíneos recién formados más pequeños, cuyo diámetro a aumentos más altos se ha encontrado que es de aproximadamente 2,5 a 3,0 micrómetros, pueden distinguirse claramente. El hecho de que el diámetro medio de los eritrocitos de rata sea igual o mayor a 6,3 micrómetros muestra lo pequeños que son estos vasos. El área de todas las partes vascularizadas en una ventana como porcentaje del área de toda la ventana se conoce como el área vascularizada relativa va.

Es, a todos los efectos, una medición de la extensión espacial de los vasos, ya que tienen esencialmente una extensión bidimensional; la VA se puede medir fácilmente mediante telemetría asistida por computadora, por ejemplo. El siguiente paso consiste en registrar la densidad de los microvasos y la formación de patrones dentro de tres partes centrales de las áreas vascularizadas de cada ventana. Estas partes se eligen sistemáticamente al azar con un aumento óptico de 80.

Cada vaso se visualiza como una sola línea utilizando un microscopio de dibujo. La imagen de cada campo de visión se transfiere a una imagen digitalizada y a un analizador de imágenes, y luego cada vaso en la imagen digitalizada se reduce a un grosor de un píxel. La máquina mide entonces el número de píxeles, que representa los vasos y se expresa como una fracción de todos los píxeles en el campo de visión.

Esta cifra porcentual, la longitud microvascular o MVL, representa la longitud de los microvasos en cada unidad del área vascularizada y es una medida compuesta de la densidad de microvasos. Al multiplicar el valor promedio de VA de cuatro ventanas por animal por el valor medio de MVL del grupo de tratamiento correspondiente, se calcula la longitud total de microvasos por animal, o TMVL. Además, hemos desarrollado técnicas para el análisis cuantitativo detallado de la densidad y composición de microvasos mediante análisis de imágenes.

Estos incluyen la medición de la distancia real entre dos microvasos sucesivos, puntos de ramificación, IE, la longitud de microvasos individuales, segmentos LEMS, el número de microvasos, segmentos por unidad de volumen de tejido, NOMS, y el número de puntos de ramificación de microvasos por unidad de volumen de tejido, NOBP. El grado de tortuosidad en los microvasos, MVT, se determina por la diferencia entre la distancia más corta y la distancia real entre dos puntos de ramificación sucesivos, la presencia de microvasos que se cruzan, el índice de intersección INIS, y la formación de bucles interconectados. El índice de formación de bucles, INLF, también puede medirse con precisión mediante técnicas similares en la periferia de la red de microvasos.

También podemos cuantificar variables correspondientes para brotes, incluyendo la longitud de los brotes, LESP, y el número de brotes por unidad de volumen tisular, NOSP, diseñando ensayos dado que pueden existir diferencias significativas entre animales dentro del mismo grupo de tratamiento e incluso entre ventanas mesentéricas en un mismo animal. Hemos encontrado que el siguiente diseño puede resultar práctico: el número de animales por grupo de tratamiento durante el período de observación, de ocho a doce; el número de ventanas por animal que se analizan en términos de VA; el número de campos de visión por cada ventana que se analizan en términos de longitud microvascular, MVL; longitud de los microvasos, segmentos, LEMS; número de segmentos de microvasos, NOMS; número de puntos de ramificación de microvasos, NOBP; tortuosidad de los microvasos, MVT; índice de intersección, I; índice de formación de bucles, INF. Se utilizan tres animales tratados con vehículo como controles. El ensayo de angiogénesis en la ventana mesentérica es especialmente adecuado para estudios de efecto dosis-respuesta y para análisis cinéticos de la angiogénesis.

Esto puede realizarse tratando grupos de animales con diferentes dosis de un factor proangiogénico y sacrificando estos animales en diferentes puntos temporales durante la respuesta angiogénica. De este modo, puede discernirse en términos cuantitativos la fase expansiva, el pico y la subsiguiente fase angiorregresiva. Estudios de este tipo han revelado que la respuesta angiogénica de novo a cualquier citocina factor de crecimiento ensayada es específicamente dependiente de la dosis en cuanto a velocidad, potencia y duración.

Además, el patrón de los nuevos vasos en cuanto a la extensión espacial y los cambios en los microvasos, la densidad suele ser marcadamente dependiente de la dosis y del tiempo en comparación con la angiogénesis mediada por VEGF o FGF básico a dosis aproximadamente fisiológicas. La angiogénesis mediada por mastocitos, MCMA inducida mediante la activación selectiva de mastocitos in situ, presenta una potencia considerablemente mayor y una duración notablemente más prolongada. De hecho, la angiogénesis mediada por mastocitos fue descrita por primera vez utilizando este ensayo debido a la capacidad de cuantificar variables objetivas de angiogénesis, al alto grado de relevancia biológica del sistema y a la posibilidad de verificar tratamientos tóxicos.

La metodología es especialmente adecuada para los análisis de estructura-actividad y de respuesta a la dosis. El ensayo MWAA en ratas incluye un modelo para estudiar la angiogénesis en un tejido visceral vascularizado de forma nativa en adultos que carece de angiogénesis fisiológica y que no se ve afectado por cirugía, excluyendo así cualquier influencia de la angiogénesis inducida por cicatrización. El ensayo es verdaderamente cuantitativo y evalúa con precisión varias variables objetivas biológicamente relevantes que describen la extensión espacial, la densidad y la formación de patrones de los microvasos.

El ensayo es muy adecuado para estudiar los efectos sistémicos de la angiogénesis, los factores moduladores, así como para investigaciones sobre la relación estructura-actividad y la respuesta a la dosis. La metodología descrita aquí ha sido desarrollada en el laboratorio del Dr. Kloss Carl Norby, del Departamento de Patología, del Hospital Universitario Reka, Universidad Jute Borg de Gotemburgo en Suecia. Todos los estudios de este proyecto han sido financiados por el Consejo Sueco de Investigación Médica, número de proyecto 5 9 4 2.

Se agradece la hábil asistencia técnica de la Sra. Gun Effer, quien ha participado desde el inicio del proyecto, de la Sra. Monica Anderson, no presente, y de la Sra. Ann Nemar Lindgren.

Espero que esta breve presentación le haya dado una idea del potencial del ensayo. Si utiliza este ensayo en su laboratorio, estaré encantado de ayudarle si encuentra algún problema técnico. Asimismo, agradecería mucho cualquier sugerencia que pudiera tener.

Gracias.