Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Hola, soy Victor Chi y soy estudiante de posgrado en el laboratorio de Chandy, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Hoy voy a demostrar cómo teñir secciones incluidas en parafina utilizando el kit A b, C de Vector Laboratories. Este procedimiento incluye desparafinar e hidratar secciones incluidas en parafina, realizar la recuperación de antígenos inducida por calor para desenmascarar los antígenos, bloquear la peroxidasa y la unión proteica no específica, incubar con anticuerpos primarios CD cuatro y tirosina hidroxilasa y con anticuerpos secundarios, y revelar y montar el portaobjetos.

Así que comencemos. Dado que los portaobjetos están encerados en parafina, el primer paso es desparafinarlos. Esto se realiza generalmente en una campana extractora utilizando tres frascos de xileno, tras tres lavados que consisten en cinco minutos cada uno.

A continuación, se colocan los portaobjetos en etanol al cien por cien. Observará que la parafina de los portaobjetos ha desaparecido, pero tenga cuidado de no manipular los portaobjetos con guantes, ya que el xileno disuelve el caucho de los guantes. Luego, se trasladan los portaobjetos en etanol al cien por cien de vuelta al laboratorio, donde experimentarán un gradiente de hidratación.

Aquí voy a hablarles sobre el gradiente de hidratación al que someteremos nuestras preparaciones. Comienza primero con dos baños de etanol al cien por ciento. A partir de ahí, transferimos nuestras preparaciones a dos baños compuestos por etanol al 95 %.

Luego transferimos nuestros portaobjetos a un baño de etanol al 70 %, y desde allí los transferimos a un baño de etanol al 50 %. Después de eso, transferimos nuestros portaobjetos a etanol al 30 %, y dos minutos más tarde los transferimos a agua doblemente destilada. Y tras el tratamiento con agua doblemente destilada, dejaremos que nuestro portaobjetos permanezca en PBS.

Ahora voy a mostrarle cómo transportar las laminillas de un baño al siguiente en las portaplacas. El primer paso consiste en utilizar el portador de portaplacas para retirar las laminillas y raspar suavemente a fin de eliminar el exceso de líquido, de modo que no transporte demasiado líquido al siguiente baño. A continuación, sumérjalas y espere dos minutos hasta el siguiente cambio de gradiente.

En muchas ocasiones, cuando los tejidos están fijados, el antígeno queda enmascarado de tal manera que el anticuerpo no puede unirse a él. Por eso, ahora voy a mostrarles un método de recuperación de antígenos inducida por calor, utilizando citrato sódico. Ahora estamos aquí en el microondas, donde voy a desenmascarar mi antígeno CD8, que intentaré detectar mediante inmunohistoquímica.

Aquí voy a colocar mi solución y la calentaré en el microondas durante 15 minutos. Herviremos el citrato de sodio junto con nuestras laminillas durante 15 minutos para asegurarnos de que no se sequen. Vigilaremos nuestras laminillas y, si hierve en exceso, rellenaremos con citrato de sodio para garantizar que las laminillas permanezcan hidratadas.

Entonces, antes de colocar mis portaobjetos en el citrato de sodio, ya he precalentado mi solución durante 45 segundos. Luego he colocado mis portaobjetos en el citrato de sodio y ahora estoy calentando el citrato de sodio durante 15 minutos, con los portaobjetos dentro. Por lo general, la solución comienza a hervir y desbordarse aproximadamente entre los dos y dos minutos y medio del proceso de ebullición.

En ese momento, detendré el proceso y reemplazaré el citrato de sodio perdido con citrato de sodio fresco. Después de hervir el citrato de sodio durante 15 minutos, queremos retirar nuestras portaobjetos y la solución y enfriarlos. La mejor manera de hacerlo es tapar el portaportaobjetos, verter el líquido excedente y pasar agua fría corriente sobre él hasta que la solución dentro del frasco se enfríe a temperatura ambiente.

Y esto generalmente toma entre 10 y 15 minutos. Entonces, después de retirar nuestras laminillas del lavabo, necesitamos bloquear la actividad de peroxidasa endógena en los tejidos. Para ello, prepararemos una solución de peróxido de hidrógeno utilizando peróxido de hidrógeno al 30% y preparando una solución de peróxido de hidrógeno al 1%.

Y desde aquí, simplemente transfiero los portaobjetos directamente a la solución de peróxido de hidrógeno. Ahora, incubaremos nuestros portaobjetos en el peróxido de hidrógeno durante 20 minutos. Transcurridos estos 20 minutos, tras bloquear la peroxidasa endógena, voy a lavar el peróxido de hidrógeno de los portaobjetos utilizando lavados con PBS.

Así que voy a transferir mis portaobjetos al porta-muestras y lavarlos con tres lavados, cada uno de cinco minutos. Estos portaobjetos se han colocado uno detrás de otro para evitar el contacto con otros portaobjetos que podrían dañar el tejido. Simplemente estoy deslizando los portaobjetos y los estoy organizando de manera que el tejido no tenga posibilidad alguna de entrar en contacto con el vidrio.

A continuación, transferimos nuestras laminillas a PBS. Después de lavar las laminillas con PBS, ahora procederé a bloquearlas para evitar la unión no específica de proteínas, utilizando una solución de 5 % BSA, 5 % suero de cabra y 0,1 % de azida sódica. Por lo tanto, debe cambiar el suero de cabra a una especie diferente si está trabajando con anticuerpos de cabra.

Así que ahora mismo voy a colocar las laminillas en el portaobjetos y a llenarlo con nuestra solución. Normalmente solo lo lleno hasta la mitad, de modo que el volumen de las laminillas garantice que los tejidos queden sumergidos. Una cosa que debe asegurarse al colocar las laminillas en el recipiente es evitar que estos tejidos toquen los lados del recipiente.

Para el último portaobjetos, gírelo hacia adentro para que el tejido no toque el recipiente. Ahora que he bloqueado mis portaobjetos durante toda la noche, voy a lavar la solución de bloqueo en exceso con tres lavados de cinco, cada uno consistente en cinco minutos en PBS. En este momento, queremos dibujar un círculo usando el repelente líquido alrededor de nuestro tejido para minimizar la cantidad de anticuerpo utilizada.

Si no le preocupa conservar el anticuerpo, entonces siempre puede incubar las laminillas en las mismas cápsulas que usamos para el paso de bloqueo. A partir de ahora, le mostraré cómo dibujamos con el bloqueador líquido alrededor de nuestro tejido. Primero, eliminamos la sangre y el exceso de líquido, teniendo cuidado de no tocar el tejido.

Así que limpie suavemente las esquinas para eliminar el exceso de líquido. Nuevamente, tenga mucho, mucho cuidado de no tocar el tejido. Tome la punta para bloqueo líquido, presione suavemente para iniciar el flujo y, a partir de ahí, rodee el tejido con su punta.

Deje secar el bloqueador líquido durante aproximadamente 15 segundos. En este momento, se debe añadir el anticuerpo primario. Utilizando una pipeta, asegúrese de cubrir el tejido con su anticuerpo primario y transfiéralo a su caja con control de humedad.

Así que usamos una toalla Kim. Hemos humedecido con un poco de agua desionizada esta caja para evitar que el portaobjetos se seque mientras incuba con el anticuerpo primario. Ahora que nuestro anticuerpo primario ha estado incubando durante una hora, vamos a retirar nuestros portaobjetos y lavar el anticuerpo en exceso con PBS.

Así que nuevamente, permita que el líquido drene e insértelo en su lavado con PBS. Y nuevamente, lave tres veces durante cinco minutos. Después de nuestros tres lavados de cinco minutos, vamos a añadir nuestro anticuerpo secundario a nuestro tejido de la misma manera que añadimos el anticuerpo primario.

Entonces, utilizando solo el volumen suficiente para cubrir sus tejidos, agregue su anticuerpo secundario, que en nuestro caso es de cabra anti conejo, y coloque nuevamente su portaobjetos en la cámara con control de humedad. Estamos utilizando un anticuerpo secundario biotinilado de cabra anti conejo, lo cual es esencial cuando se emplea el método ABC. Por lo tanto, transferimos nuestro portaobjetos a la cámara con control de humedad y lo dejamos incubar durante una hora.

Mientras el anticuerpo secundario está en incubación, debemos preparar el reactivo A BC. Estamos utilizando el reactivo A, B, C de Vector Laboratories del kit de tinción Vector. Retire el reactivo a, prímelo y permita que caiga tres veces en 15 mililitros de PBS, teniendo cuidado de no apretar el tubo, ya que las gotas deben estar específicamente dosificadas y de un tamaño determinado.

Después de que el anticuerpo secundario haya incubado durante aproximadamente una hora, tome sus portaobjetos y lávelos nuevamente en PBS, tal como lo hizo con el anticuerpo primario. Después de tres lavados de cinco minutos cada uno, transfiera sus portaobjetos a este recipiente, donde agregará el reactivo A, B, C, que preparó entre 30 y 45 minutos antes. Simplemente añada el reactivo A, B, C aquí, cubra completamente los portaobjetos y deje que incube otros 30 a 45 minutos.

Después de que sus portaobjetos hayan permanecido en A, B, C durante aproximadamente de 3 a 5 minutos, queremos lavar la solución excesiva de A, B, C. Simplemente retire los portaobjetos y colóquelos en su solución de PBS. Queremos repetir el mismo procedimiento de lavado tres veces en PBS, durante cinco minutos cada lavado.

Mientras las laminillas se lavan, preparo el sustrato de peroxidasa DAB de Vector Laboratories. Tomo el tampón de pH 7,5 y añado dos gotas. Después del tampón de pH 7,5, tomo el reactivo sustrato DAB y añado dos gotas de este.

Nuevamente, el tamaño de la gota es crítico, así que no apriete el frasco y simplemente deje caer las gotas. Dos gotas para el tampón pH 7,5. Por lo tanto, debe agregar cuatro gotas del reactivo sustrato DAB, permitiendo que también caigan por gravedad.

Al final, también desea agregar dos gotas del reactivo sustrato de peróxido de hidrógeno. Así es como debe verse la mezcla de reactivo sustrato DAB. Ahora está lista para agregar a los portaobjetos; retire sus portaobjetos y permita que el PBS se drene completamente de ellos.

Con el tiempo, el reactivo DAB se vuelve más marrón. Por lo tanto, en este momento deseamos añadirlo a nuestros portaobjetos. Tome un volumen suficiente para cubrir los tejidos y añádalo directamente sobre las muestras de tejido.

Tome simplemente el volumen apropiado y añádalo directamente encima de sus muestras de tejido, y permita que la solución se desarrolle, ya que sus muestras de tejido deben volverse más marrones con el tiempo. Después de añadir su solución de DAB, puede observarse en esta sección del cerebro dónde el tejido se torna marrón aquí y aquí. La tinción marrón de DAB revela la región que contiene neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo.

Después de desarrollar sus portaobjetos durante un período de entre dos y 10 minutos, debe añadirlos al agua helada para detener la reacción. Simplemente permita que la solución se drene y coloque los portaobjetos directamente en el agua helada. Tras sumergir los portaobjetos en el agua helada, lleve el recipiente al fregadero y haga correr agua fría dentro de él durante aproximadamente cinco minutos para asegurarse de que toda la solución de DAB se haya eliminado completamente de este recipiente.

Por lo tanto, cuando agregue al sumidero, tenga cuidado de no permitir que la corriente impacte el tejido; más bien, diríjala hacia una de las esquinas y permita que simplemente rebose, de modo que sus tejidos no se vean alterados por el flujo continuo de agua. Después de retirar sus portaobjetos del lavado, debe realizar una tinción de contraste. ¿Por qué podría necesitar una tinción de contraste?

Bueno, una razón es que quizás desee observar la estructura de su tejido. Otra es visualizar todas las células. Por tanto, para nuestros fines, realizaremos una contratinción con hematoxilina, que marca los núcleos.

Entonces, queremos tomar nuestras laminillas, eliminar el líquido en exceso e introducirlas una vez en la solución de hematoxilina. Una vez sacadas, añádalas directamente al agua. Después de colocar las laminillas en el agua del grifo, debe tomarlas y enjuagarlas bajo el agua, tal como lo hizo anteriormente con el baño de agua helada.

Entonces, para el lavado de hematoína, simplemente deje correr agua hasta que el agua dentro del frasco se vuelva clara. Después de retirar nuestras laminillas contratinjidas del agua, queremos rehidratar nuestras laminillas. Por lo tanto, debemos pasarlas nuevamente por nuestro gradiente de etanol, pero en orden inverso.

Entonces, sería un lavado con agua desionizada, un lavado con etanol al 30 %, un lavado con etanol al 50 %, un lavado con etanol al 70 %, dos lavados con etanol al 95 % y dos lavados con etanol al 100 %, cada uno de dos minutos. Retire sus portaobjetos, seque el exceso de líquido y colóquelos directamente en etanol al 30 %, dejándolos reposar durante dos minutos. Después del último lavado con etanol al 100 %, deseamos devolver los portaobjetos al xileno.

Así que tome nuevamente sus portaobjetos, raspando el exceso de líquido, coloque los portaobjetos y añádalos al primer xilol durante cinco minutos. Eso implicará tres lavados consecutivos con xilol, cada uno de cinco minutos. Ahora ya estamos listos para montar nuestros portaobjetos.

Lo que suelo hacer es, un minuto antes de que estén listas las laminillas, tomar mi pipeta Pasteur y aspirar la solución de montaje permanente, dejándola reposar aproximadamente un minuto antes de que las laminillas estén listas para retirarse tras el último lavado con xileno. Después del último lavado con xileno, teniendo cuidado de no sumergir los guantes ni mojarlos con xileno, retírelas con un par de pinzas, prestando atención a qué lado contiene el tejido. Limpiar suavemente el exceso de xileno con una toallita Kim, teniendo cuidado de no tocar el tejido; simplemente limpie con cuidado las esquinas y los bordes, permitiendo que la mayor parte del xileno se evapore. Probablemente pueda trabajar con dos laminillas antes de que una de ellas se seque por completo.

Mientras termina de secar un portaobjetos, el otro portaobjetos debería estar listo para usar. Ahora debe trabajar con ellos antes de que se sequen por completo. Así que debe tomar su perimount y trazar una línea fina al lado de su tejido, teniendo cuidado de no tocar el tejido.

Retire el perimontaje tomando su cubreobjetos. Aplíquelo en un ángulo de 45 grados y permita que se doble hacia abajo. Luego deslice su cubreobjetos, asegurándose de que el perimontaje cubra todos los tejidos.

Luego colóquelo y colóquelo sobre la superficie, presionando suavemente en el centro para eliminar todas las burbujas de aire excesivas. Deje que se seque mientras trabaja en su segundo tejido; este es el momento de observar nuestras preparaciones, aunque no en realidad. Por lo tanto, debemos permitir que el montaje permanente se seque durante la noche antes de examinar nuestras preparaciones.

De lo contrario, a la luz del microscopio, el montaje permanente formará burbujas y luego arruinará su muestra. A continuación se muestra un aspecto de nuestras secciones cerebrales después de la tinción con productos químicos, anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la tirosina hidroxilasa. Nuevamente, la tinción marrón con DAB muestra la ubicación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo.

La contratiñación con hematina tiñe de azul todos los núcleos en este tejido. Así que acabo de mostrarle cómo teñir secciones incluidas en parafina utilizando el kit ABC de Vector Laboratories. Ahora deberá ajustar las condiciones según los tipos de tejido que vaya a teñir y los anticuerpos que utilice.

Así que buena suerte en sus experimentos.