Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Hola, soy Victor Chi y soy estudiante de posgrado en el Laboratorio Chandy en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California Irvine. Hoy voy a demostrar cómo teñir secciones incrustadas en parafina utilizando el kit A, b, C de Vector Laboratories. Este procedimiento consiste en desencerar e hidratar secciones incluidas en parafina, realizar la recuperación de antígenos inducida por calor para desenmascarar antígenos, bloquear la peroxidasa y la unión a proteínas no específicas, incubar con CD cuatro y tirosina hidroxilasa y anticuerpos secundarios, y revelar y montar el portaobjetos.

Así que comencemos. Dado que los portaobjetos están codificados en parafina, el primer paso es desparafinar los portaobjetos. Esto se hace generalmente en una campana extractora usando tres frascos de xileno después de tres lavados que constan de cinco minutos para cada lavado.

A continuación, los portaobjetos se introducen en etanol al cien por cien. Notarás que la cera de los portaobjetos ha desaparecido, pero ten cuidado de no manipularlos con guantes porque el xileno disolverá la goma de los guantes. A partir de ahí, se trasladan los portaobjetos en etanol al cien por cien al laboratorio, donde se someten a un gradiente de hidratación.

Así que aquí os voy a hablar del gradiente de hidratación por el que van a pasar nuestros toboganes. Primero comienza con dos baños de etanol al cien por cien. A partir de ahí, transferimos nuestros toboganes a dos baños que constan de un 95% de etanol.

Luego transferimos nuestros portaobjetos a un baño de 70% de etanol, y desde allí transferiremos nuestros portaobjetos a un baño de 50% de etanol. Después de eso, transferimos nuestros portaobjetos a etanol al 30%, y dos minutos después transferiremos nuestros portaobjetos a agua destilada doble. Y tras el tratamiento con agua bidestilada, dejaremos reposar nuestro tobogán en PBS.

Así que ahora te voy a enseñar cómo llevar los toboganes de un baño a otro en los carruajes. Por lo tanto, el primer paso es usar el soporte del carro, quitar las correderas y raspar suavemente para eliminar el exceso de líquido y no llevar demasiado líquido a su próximo baño. A partir de ahí, sumérgelo y espera dos minutos hasta el próximo cambio de degradado.

Muchas veces, cuando los tejidos se fijan, el antígeno se enmascara para que el anticuerpo no pueda unirse a él. Así que lo que voy a hacer ahora es mostrarles un método de recuperación de antígenos inducido por calor usando citrato de sodio. Así que ahora estamos aquí en el microondas donde voy a desenmascarar mi antígeno CD ocho, del cual intentaré detectar usando inmunohistoquímica.

Y aquí voy a poner mi solución y calentarla en el microondas durante 15 minutos. Así que herviremos nuestro citrato de sodio con nuestros portaobjetos durante 15 minutos para asegurarnos de que nuestros portaobjetos no se sequen. Estaremos vigilando nuestros portaobjetos para que, al hervir, los volvamos a llenar con citrato de sodio para asegurarnos de que los portaobjetos permanezcan hidratados.

Entonces, antes de poner mis portaobjetos en el citrato de sodio, ya precalenté mi solución durante 45 segundos. Luego puse mis portaobjetos en el citrato de sodio y ahora estoy calentando mi citrato de sodio durante 15 minutos. Con los portaobjetos dentro, por lo general, la solución comenzará a hervir aproximadamente a los dos o dos minutos y medio del proceso de ebullición.

En ese momento, me detendré y reemplazaré el citrato de sodio perdido con citrato de sodio fresco. Después de hervir el citrato de sodio durante 15 minutos, queremos retirar nuestros portaobjetos y la solución y enfriarlos. Por lo tanto, la mejor manera de hacer esto es tapar el portaobjetos, verter el exceso de líquido y simplemente pasarlo por un chorro de agua fría hasta que la solución dentro del frasco se enfríe a temperatura ambiente.

Y esto suele tardar entre 10 y 15 minutos. Entonces, después de retirar nuestros portaobjetos del fregadero, debemos bloquear la actividad de la peroxidasa endógena en los tejidos. Lo que vamos a hacer es hacer una solución de peróxido de hidrógeno utilizando un 30% de peróxido de hidrógeno y haciendo una solución de peróxido de hidrógeno al 1%.

Y desde aquí, simplemente transfiero los portaobjetos directamente a la solución de peróxido de hidrógeno. Y ahora incubaremos nuestros portaobjetos en el peróxido de hidrógeno durante 20 minutos. Ahora, después de que hayan pasado 20 minutos, después de bloquear la peroxidasa endógena, voy a lavar el peróxido de hidrógeno de los portaobjetos con lavados de PBS.

Así que voy a transferir mis portaobjetos al carro y lavarlo con tres lavados de cinco minutos cada uno. Por lo tanto, estos portaobjetos se han colocado espalda con espalda para evitar el contacto con los otros portaobjetos que pueden dañar el tejido. Así que simplemente me deslizo de los portaobjetos y los coloco de modo que el pañuelo no tenga posibilidad de entrar en contacto con el cristal.

Allí transferimos nuestras diapositivas a PBS. Entonces, después de lavar nuestros portaobjetos con PBS, ahora voy a bloquear los portaobjetos para la unión inespecífica de proteínas con una solución de 5% BSA, 5% de suero de cabra y 0.1% de azida de sodio. Por lo tanto, desea cambiar el suero de cabra a otra especie si está trabajando con anticuerpos de cabra.

Así que ahora mismo, voy a poner las diapositivas en nuestro soporte de diapositivas y llenarlo con nuestra solución. Así que normalmente lo lleno hasta la mitad para que el volumen de los portaobjetos se asegure de que los tejidos estén sumergidos. Por lo tanto, una cosa de la que debe asegurarse al colocar los portaobjetos en el recipiente es evitar que estos tejidos toquen los lados del recipiente.

Entonces, para el último portaobjetos, gírelo hacia adentro para que el pañuelo no toque el recipiente. Así que ahora que he bloqueado mis diapositivas durante la noche, voy a lavar el exceso de solución de bloqueo con tres lavados de cinco, que consisten en cinco minutos en PBS. Entonces, en este punto, queremos dibujar un círculo usando bloqueador líquido alrededor de nuestro tejido para minimizar la cantidad de anticuerpos utilizados.

Si no te preocupa conservar el anticuerpo, siempre puedes incubar los portaobjetos en las mismas tripas en las que hicimos el paso de bloqueo. Así que a partir de este punto, te voy a mostrar cómo dibujamos con bloqueador líquido alrededor de nuestro tejido. Así que primero eliminamos la sangre del exceso de líquido, con cuidado de no tocar el tejido.

Así que sólo tienes que pasar por las esquinas para eliminar el exceso de líquido. De nuevo, tener mucho, mucho cuidado de no tocar el tejido. Tome el alfiler bloqueador de líquidos, presione suavemente para que el flujo fluya y, a partir de ahí, rodee el pañuelo con su bolígrafo.

Deje que el bloqueador de líquidos se seque durante unos 15 segundos. En este punto, queremos agregar el anticuerpo primario. Y así, con una pipeta, asegúrese de cubrir el tejido con su anticuerpo primario y transfiéralo a su caja de humedad controlada.

Así que usamos una toallita Kim. Nos casamos con un poco de agua di en esta caja para evitar que el portaobjetos se seque mientras se incuba con el anticuerpo primario. Ahora que nuestro anticuerpo primario ha estado incubando durante una hora, vamos a retirar nuestros portaobjetos y lavar el exceso de anticuerpo con PBS.

Así que, de nuevo, sólo tienes que dejar que el líquido se escurra e insértalo en tu lavado PBS. Y de nuevo, lavar tres veces durante cinco minutos. Entonces, después de nuestros tres lavados de cinco minutos, vamos a agregar nuestro anticuerpo secundario a nuestro tejido de la misma manera que agregamos nuestro anticuerpo primario.

Por lo tanto, solo use el volumen suficiente para cubrir sus tejidos, agregue su anticuerpo secundario, que estamos usando es anti conejo de cabra, y mueva su portaobjetos de regreso a la cámara de humedad controlada. Y por eso estamos usando un anticuerpo secundario, que es biotinilado contra el conejo de cabra, que es esencial cuando se usa el método A BC. Así que transferimos nuestro portaobjetos a la cámara de humedad controlada y dejamos que se incube durante una sola vez.

Entonces, mientras el anticuerpo secundario se incuba, debemos preparar el reactivo A BC. Así que estamos usando los laboratorios de vectores, el reactivo A, B, C del kit de tinción de vectores. Por lo tanto, retire el reactivo y déjelo caer tres veces en 15 mililitros de PBS, teniendo cuidado de no apretar el tubo porque las gotas deben dosificarse específicamente y ser de un tamaño específico.

Entonces, después de que su anticuerpo secundario haya terminado de incubarse durante aproximadamente una hora, toma sus portaobjetos y los pone, los lava nuevamente en PBS, tal como lo hizo con su anticuerpo primario. Entonces, después de tres lavados de cinco minutos cada uno, transfiere sus portaobjetos a este recipiente donde agrega su reactivo A, B, C, que preparó con 30 a 45 minutos de anticipación. Y así, sólo tienes que añadir tu reactivo A, B, C aquí y rellenar tus portaobjetos y dejar que se incuben durante otros 30 a 45 minutos.

Entonces, después de que sus portaobjetos hayan estado en a, B, C durante aproximadamente 34 a cinco minutos, queremos lavar el exceso de solución A, B, C. Así que sólo tienes que quitar tus diapositivas y añadirlas a tu solución PBS. Y por eso queremos repetir el mismo procedimiento de lavado tres veces en PBS durante cinco minutos en cada lavado.

Mientras se lavan los portaobjetos, preparo el sustrato de peroxidasa DAB de los laboratorios de vectores. Tomo el tampón de pH 7.5 y agrego dos gotas. Después del tampón de pH 7.5, tomo el reactivo de reacción del sustrato DAB y agrego dos gotas de eso.

Una vez más, el tamaño de la gota es fundamental, así que no aprietes la botella y simplemente dejes que caigan las gotas. Dos gotas para tampón pH 7,5. Por lo tanto, debe agregar cuatro gotas del reactivo de sustrato DAB, permitiendo que también caiga.

También desea agregar al final, desea agregar dos gotas del reactivo de sustrato de peróxido de hidrógeno. Así es como debería verse la mezcla de reactivos de sustrato DAB. Ahora está listo para agregar a las diapositivas, eliminar las diapositivas y permitir que el PBS se drene de las diapositivas.

Entonces, con el tiempo, el reactivo DAB se vuelve más marrón. Así que queremos agregarlo a nuestras diapositivas en este punto. Por lo tanto, tome suficiente volumen para cubrir los tejidos y simplemente agréguelo directamente sobre las muestras de tejido.

Por lo tanto, simplemente tome el volumen apropiado y agréguelo directamente sobre sus muestras de tejido, y permita que la solución se desarrolle, ya que sus muestras de tejido deberían volverse más marrones con el tiempo. Después de agregar su solución DAB, puede ver en esta sección del cerebro donde el tejido se vuelve marrón aquí y aquí. El pie marrón DAB revela la región que contiene las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo.

Después de desarrollar sus diapositivas de dos a 10 minutos, desea agregar su, por lo que desea agregar sus diapositivas al agua helada para detener la reacción. Así que deja que la solución se drene y añade los portaobjetos directamente al agua helada. Después de sumergir sus portaobjetos en el agua helada, lleve su baño al fregadero y deje correr agua fría durante aproximadamente cinco minutos para asegurarse de que toda la solución DAB se drene de este baño.

Por lo tanto, cuando agregue el fregadero, tenga cuidado de no dejar que el chorro golpee el tejido y que golpee una de las esquinas y permita que se desborde para que sus pañuelos no se vean perturbados por el flujo de agua. Entonces, después de quitar los portaobjetos del lavado, debes hacer una contramancha. Entonces, ¿por qué querrías una contramancha?

Bueno, una de las razones es que es posible que desee ver la estructura de su tejido. Otra es visualizar todas las celdas. Entonces, para nuestros propósitos, vamos a contrarrestar la tinción con hemat toína, que significa núcleos.

Así que queremos tomar nuestros portaobjetos, eliminar el exceso de líquido y sumergirlo una vez en la solución de Hemat Hematin. Uno, sácalo y añádelo directamente al agua. Después de agregar sus toboganes en el agua del grifo, desea tomar sus toboganes y pasarlos bajo el agua, tal como lo hizo anteriormente con el baño de agua helada.

Entonces, para el lavado de hemat Toin, simplemente déjelo correr bajo agua corriente hasta que el agua dentro del frasco se aclare. Entonces, después de quitar nuestros portaobjetos manchados del agua, queremos volver a deshidratar nuestros portaobjetos. Y por eso queremos volver a ponerlo a través de nuestro gradiente de etanol, pero en orden inverso.

Así que sería un lavado con agua desionizada, un lavado con 30% de etanol, un lavado con 50% de etanol, un lavado con 70% de etanol, dos lavados y 95% de etanol, y dos lavados, y 100% de etanol cada uno que consta de dos minutos cada uno. Así que retira los portaobjetos, limpia el exceso de líquido y añádelo directamente a tu etanol al 30%, y déjalo reposar durante dos minutos. Entonces, después del último lavado con etanol al cien por cien, queremos volver a colocar los portaobjetos en el xileno.

Así que vuelve a coger los portaobjetos, raspando el exceso de líquido, coge los portaobjetos y añádelos al primer xileno durante cinco minutos. Así que serán tres lavados consecutivos de xileno durante cinco minutos cada uno. Y ahora estamos listos para montar nuestras diapositivas.

Así que lo que suelo hacer es un minuto antes de que los portaobjetos estén listos, cojo mi pipeta de pasto y saco la solución de montaje permanente, y dejo que pase aproximadamente un minuto antes de que mis portaobjetos estén listos para salir. Después del último lavado de xileno, teniendo cuidado de no sumergir los guantes ni mojarlos con xileno, Retíralos con unas pinzas teniendo cuidado de qué lado contiene el pañuelo. Limpie suavemente el exceso de XLE con una toallita Kim, teniendo cuidado de no tocar el pañuelo, simplemente limpie con cuidado las esquinas y los bordes, permitiendo que la mayor parte del xileno se evapore. Probablemente puedas trabajar en dos portaobjetos antes de que uno se seque.

Entonces, cuando termine de secar un portaobjetos, el otro portaobjetos debería estar listo para trabajar. Ahora tienes que trabajar con ellos antes de que se sequen por completo. Por lo tanto, debes tomar tu perimontaje y dibujar una línea delgada junto a tu tejido, teniendo cuidado de no tocar tu tejido.

Retire el montaje periférico tomando su cubreobjetos. Aplícalo en un ángulo de 45 grados y deja que se doble. Y luego deslice su cubreobjetos, asegurándose de que el perimount cubra todos los tejidos.

A continuación, colóquelo y presione suavemente en el centro para eliminar todo el exceso de burbujas de aire. Deje que se seque mientras trabaja en su segundo tejido es el momento de mirar nuestros portaobjetos, no realmente. Por lo tanto, debemos dejar que la montura permanente se seque durante la noche antes de mirar nuestras diapositivas.

De lo contrario, bajo la luz del microscopio, la montura permanente burbujeará y luego arruinará su muestra. Aquí hay un vistazo a nuestras secciones del cerebro después de teñir con productos químicos, anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra la tirosina hidroxilasa. Una vez más, la tinción marrón DAB muestra la ubicación de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo.

La contratinción de hematina hace que todos los núcleos de este tejido se vuelvan azules. Así que te acabo de mostrar cómo teñir secciones incrustadas en parafina utilizando el kit A BC de Vector Laboratories. Ahora querrá ajustar las condiciones de acuerdo con los tipos de tejido que va a teñir y los anticuerpos que va a utilizar.

Así que buena suerte en tus experimentos.