Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Hola, mi nombre es Rob Edwards. Soy director de la instalación de microscopía de captura láser de la Universidad de California en Irvine. Voy a describirle el uso del microscopio de captura láser que tenemos aquí.

Nuestro instrumento es un Leica A-S-L-M-D, que adquirimos hace aproximadamente tres años. Existen dos tipos diferentes de sistemas de captura láser. Uno puede compararse con un soldador puntual en el que se tiene un fragmento de tejido sobre un portaobjetos de vidrio recubierto por una membrana plástica, la cual se sitúa encima del tejido.

Una fuente láser se utiliza entonces para fundir la membrana, soldando efectivamente el tejido a la membrana, y luego se retira dicha membrana, llevándose consigo el tejido capturado. Bien. Para iniciar el sistema de MAC, encendemos varios instrumentos en secuencia aquí. Comenzaremos con la caja de control A-S-L-M-D, que se enciende aquí.

Luego encendemos la computadora, lo cual es bastante sencillo. Si se tiene una muestra que requiere óptica de fluorescencia para identificar las células que se van a capturar, se encendería la lámpara de mercurio para la iluminación de fluorescencia. No vamos a utilizar eso para esta demostración.

Si desea capturar imágenes de alta calidad de las muestras antes y después, se puede encender la cámara de punto independientemente justo aquí, después de encender la caja lógica y la computadora; a continuación, se enciende la unidad de control de potencia del láser aquí, que en realidad se enciende mediante una llave situada en la parte inferior del instrumento. Finalmente, se enciende el monitor de la computadora. Existen varios controles en la pantalla con los que deberá familiarizarse.

Usted los utilizará con bastante frecuencia. Este es un programa clásico basado en Microsoft Windows, por lo que analizaremos varias opciones del menú. Pero primero permítame hablar sobre el escritorio aquí.

Hay una ventana en vivo que le mostrará lo que el microscopio está viendo realmente. Y a lo largo de la barra de menú aquí arriba, puede ver un botón para imágenes en vivo y también un botón de pausa que puede alternar, y luego usar el menú de archivo para capturar imágenes fijas de una porción de tejido, por ejemplo antes y después de la captura, con el fin de documentar el tejido que ha aislado. El microscopio puede funcionar en modo de campo claro o en modo de fluorescencia, dependiendo de si está capturando tejido teñido con contraste de hematina o tejido teñido con fluorescencia.

Los dos botones siguientes incluyen el modo de muestra, que enfoca el plano del portaobjetos del microscopio, y luego hay un modo colector que retira la portaobjetos y permite visualizar el tejido capturado en la parte superior del tubo de recolección. Esta es una configuración de tipo control de calidad. A continuación, en la barra de menú, hay varias herramientas de dibujo que utilizará para identificar las porciones de tejido o células que desea capturar.

Luego, en el lado derecho de la pantalla, hay algunas herramientas adicionales de dibujo y captura, que incluyen opciones de formas de dibujo, opciones de corte y los botones de control de corte. También en el panel de control ubicado en la parte inferior se encuentra el dispositivo colector, que es la parte del microscopio situada debajo de la platina y que sostiene los tubos einor en los cuales se captura el tejido. Estos cuatro botones etiquetados como A, B, C y D controlan qué tubo debe moverse directamente debajo del espécimen que se está capturando.

Este es un ejemplo de un tejido de sección congelada que ha sido procesado para microdisección por captura láser. Estas son secciones coronales de la cabeza embrionaria de un ratón que han sido capturadas en un portaobjetos de lámina metálica. Se trataba de secciones congeladas de ocho micrones que luego se secaron, contratinjeron con hematina y almacenaron a menos 80 grados Celsius hasta su uso.

Para montar estas preparaciones en el microscopio, el microscopio viene con un soporte especial y recuerde que el tejido se capturará en un tubo einor que se encuentra debajo del plano de la platina. Por lo tanto, el tejido está en este lado de la preparación. En realidad, se montará en el portaobjetos con el lado del tejido hacia abajo, así.

El portaobjetos encaja allí y queda sujeto en su lugar mediante presión de resorte. Y luego este intacto, este orificio. El portaobjetos se coloca sobre la platina del microscopio entre estas dos guías.

Observará que hay un pequeño tope que encaja debajo de una abrazadera en la parte trasera del portaobjetos, sujetando la muestra en su lugar. Y al insertarlo, se siente un clic definido. Bien, lo siguiente que debe configurarse son los tubos einor, que en realidad capturarán el tejido.

Se tiene la opción de utilizar tubos einor de 0.2 o 0.5 mililitros, y estos encajan en estos pequeños soportes que, a su vez, se colocan en esta bandeja, la cual va en una ranura especial debajo del escenario. De este modo, el tejido quedará retenido dentro de la parte superior de la tapa del tubo einor. Y el tubo einor que estoy utilizando aquí, a efectos ilustrativos, es de 0.5 mililitros.

Entonces, la tapa se coloca así, deslizándola por debajo, y luego los bordes de la tapa quedan sujetos en su lugar por esos dientes, y después la tapa se engancha por debajo de este modo, y luego toda esta tapa se introduce en el soporte. Ahora bien, si se están capturando ácidos nucleicos, particularmente para el aislamiento de ARN, se puede colocar una gota de varias cientos de microlitros de una solución de triol directamente en la tapa. Es importante no derramarla dentro del instrumento, por supuesto, debido al fenol y otros productos químicos cáusticos presentes en el reactivo de triol.

Este es el control del microscopio, como mencioné anteriormente; los objetivos, así como la iluminación y el enfoque, son completamente motorizados en este instrumento. Por lo tanto, el mando de enfoque se encuentra aquí en la parte superior. El control de traslación en Y para la platina es este mando.

El control de traslación en el eje X está aquí. En la parte inferior izquierda se encuentra el control del diafragma, que varía la iluminación; además, el microscopio recuerda el nivel de iluminación establecido para cada aumento. Por lo tanto, cuando se cambia de objetivo a objetivo, la iluminación se ajusta automáticamente.

Y finalmente, en el lado derecho del controlador se encuentra el control del revolver de objetivos, que permite cambiar entre los objetivos. Este instrumento tiene cinco objetivos: uno de 4x, uno de 10x, uno de 20x, uno de 40x y uno de 63x. El primer paso para capturar realmente el tejido consiste en alinear el microscopio de modo que lo que se ve en la pantalla sea exactamente lo que se capturará, con el fin de alinear el microscopio.

Pasamos a la opción del menú láser y seleccionamos calibrar, luego aceptamos y pulsamos continuar. Ahora estoy en la configuración de cuatro x y se puede observar un área relativamente grande de membrana aquí. Observe que no hay tejido.

Realizamos el alineado en una esquina del portaobjetos. El láser ha cortado una retícula en la esquina superior derecha de la pantalla y utilizaré el ratón para centrarla en esa pantalla y luego hacer clic sobre la retícula y hacer clic; el ordenador corta otra retícula. Me alinearé con esa y haré clic, y luego corta una tercera retícula y nos alineamos allí.

La calibración para el objetivo de 4x ahora está completa para el microscopio, que ya está alineado y listo para capturar realmente el tejido. Es posible que haya notado durante el proceso de alineación que las líneas cruzadas que se estaban cortando eran bastante gruesas. Y eso se debe en realidad a que la potencia de control del láser estaba ajustada a un nivel muy alto.

Probablemente no necesitamos ese grado de potencia de corte. Así que ilustraré cómo se ajusta la potencia del láser cortando una línea. Si dibujo a mano alzada una línea diagonal en la pantalla, luego selecciono una tapa y a continuación hago clic en iniciar corte, la computadora cortará siguiendo la línea que he definido.

Y puedes ver qué tan ancha es esa línea. Necesito reducir la potencia del láser. Así que hazlo.

Accedo al menú del láser, voy a control y notará que la intensidad ha sido ajustada al máximo. Voy a disminuir la intensidad del láser hasta aproximadamente 30 o así, y aceptaré esa configuración. Ahora, si trazo una nueva línea y la corto, verá que el ancho del tejido quemado o de la membrana quemada es considerablemente menor.

Y así, como principio general, se desea ajustar la potencia de control del láser al nivel más bajo posible para minimizar la cantidad de tejido que se está vaporizando. Ahora demostraré la captura real de algo de tejido utilizando este ojo de espejo. Actualmente estoy en el objetivo de Forex e intentaré capturar una porción relativamente grande de tejido.

Aislaré todo el cristalino del centro de este ojo. Para hacerlo, voy a cortar a mano alzada. Utilizando el control de dibujo en la parte superior de la pantalla, realizaré el corte.

Dibujaré una línea alrededor del espécimen que se va a capturar. Y estoy haciendo esto con una ampliación muy baja. Si se desea obtener cortes más precisos o áreas de tejido más pequeñas, obviamente se puede capturar con una ampliación más alta.

Así que he seleccionado el área que se va a cortar y ahora iré al menú de dibujo de formas; normalmente mantengo activada la opción de líneas cerradas. Lo que hace la opción de líneas cerradas es que, si se dibuja una forma irregular alrededor de un objeto y no se encierra completamente el elemento que se desea capturar, traza una línea recta entre los extremos abiertos de la forma. Entonces, con el área a cortar ya identificada, iniciaremos el proceso de corte y verá que la caja de control enfoca el láser a través de las áreas y corta casi por completo el contorno.

Suele quedar un trozo colgante a menudo al capturar fragmentos grandes de tejido. No se logra una separación completa del tejido. Por lo tanto, lo primero que se debe intentar es cortar nuevamente y el láser seguirá el contorno del tejido.

A veces, alternativamente, justo donde está colgando, puedes dibujar un pequeño espacio y cortar allí, y entonces cae. De este modo, ya hemos capturado esta porción de tejido. Como mencioné anteriormente, podemos pasar al modo colector y verificar que ese fragmento de tejido efectivamente esté dentro del colector o en la tapa del tubo einor.

Así que voy a acceder aquí al botón de control del colector, lo presionaré, y verán que el microscopio ahora cambiará la vista. Y ahora estamos observando la superficie interna del tubo einor, y hay un fragmento de tejido capturado en la parte inferior derecha de la pantalla; en realidad, podemos enfocar y ver las células individuales. De este modo, verificamos que efectivamente capturamos el tejido que seleccionamos.

Ahora bien, el proceso de captura no ocurre con una eficiencia del cien por ciento porque estos tejidos que se están capturando son esencialmente como hojas que caen. Un pequeño porcentaje determinado de fragmentos de tejido capturados no caerá dentro de la tapa del tubo einor, pero la tasa de pérdida es muy baja una vez que se ha terminado de capturar el tejido deseado. El siguiente paso, por supuesto, es retirar el tubo einor con el tejido capturado del instrumento y colocarle la tapa de forma segura.

Y para hacer esto, tiramos muy suavemente hacia afuera en línea recta del soporte así. Luego, teniendo en cuenta que se desea mantener la tapa del tubo en posición vertical, retire el soporte de la bandeja y, a continuación, saque muy cuidadosamente el tubo. Deslícelo así, extráigalo del soporte y luego mueva el einor, no la tapa, de esta manera.

Ahora, si ya se ha colocado una gota de triol en la tapa, su tejido comenzará ya el proceso de solubilización y podrá regresar a su laboratorio para completar el aislamiento de ARN. Existen varios fabricantes que producen kits de aislamiento de ARN a escala microscópica, como Amon, que es el fabricante que nosotros preferimos. Y eso es todo lo que hay que hacer.

Así que hoy les he mostrado la instalación del microscopio de captura láser aquí en la Universidad de California, Irvine. Hemos demostrado cómo capturar tejidos de secciones congeladas de portaobjetos recubiertos con lámina de aluminio, en preparación para el aislamiento de ARN de dicho tejido. Gracias por su atención y mucha suerte con su propia microdisección por captura láser.