Name: Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Aprenda a realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en Mycobacterium tuberculosis usando dilución en caldo en placas de microtitulación. Este método determina la CMI de 12 fármacos simultáneamente para guiar el tratamiento.

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Nos gustaría agradecer a los técnicos de laboratorio de la Clínica Mayo Micobacteriología laboratorio por su ayuda durante el estudio.

Cada laboratorio debe realizar una evaluación de riesgos en colaboración con su Oficial Institucional de Seguridad Biológica para determinar el nivel apropiado de bioseguridad para la preparación del inóculo y para pipetear del inóculo en la placa. En nuestro laboratorio, utilizamos el nivel 3 de bioseguridad de laboratorio (BSL3) las prácticas hasta que las placas de microtitulación se inoculan, y sellado con un sello adhesivo plástico. Estas placas se colocan dentro de una bolsa de plástico, que es el calor también está sellado. Lectura e interpretación de incubación de la placa de microtitulación se lleva a cabo en un laboratorio de bioseguridad nivel 2 (BSL2). 1. Etiquetado de los materiales <ol><li> Etiqueta de una placa de agar sangre, tres placas de Middlebrook 7H10, caldo de Middlebrook 7H9, una solución salina entre tubo de vidrio de cuentas y una placa de microtitulación AST con los identificadores adecuados (por ejemplo, el nombre del paciente, número de historia clínica) en el BSL2. </li><li> Etiqueta de la sangre y agar 7H10 plateado como "comprobar la pureza". Recuentos periódicos colonia del inóculo se recomienda asegurarse de que una concentración adecuada de los organismos se utiliza en la prueba. El recuento de colonias cuando se realiza tendrá que contar con dos de las placas de 7H10 etiquetados con "count 01.01 colonia" y del "número 1 / 50 colonias". </li></ol> 2. Preparación técnico para ir a la BSL3 <ol><li> El equipo de protección personal es necesario trabajar en la BSL3 e incluye sólido frente vestido, cubierta de la cabeza, guantes, cubiertas para los zapatos, y un respirador. Cada institución debe establecer su propio plan de protección respiratoria, en colaboración con el oficial de su institución de Higiene Industrial. En nuestro laboratorio, tenemos varios respiradores disponibles, incluida la alimentación respiradores purificadores de aire (PAPR) y equipado con filtro HEPA, los respiradores N95 mitad de la cara. </li></ol> 3. Preparación de la cabina de seguridad biológica <ol><li> En el BSL3, preparar la cabina de seguridad biológica (BSC) por la desinfección de la superficie y colocando una toalla de papel empapada con desinfectante de aproximadamente 6 pulgadas desde el panel de ventilación de aire. </li><li> Coloque un contenedor de residuos de la izquierda, y nephlometer pequeñas y vórtice de la derecha. </li><li> Bucles de inoculación, pipetors y consejos se colocan al lado de la toalla de papel. </li><li> Coloque una parrilla con el organismo (en caldo o en medio sólido) y el 0,5 McFarland estándar en la toalla de papel. </li></ol> 4. La calibración del nefelómetro <ol><li> Coloque un tubo de solución salina entre cuentas de vidrio en el nefelómetro y poner el instrumento a cero con la solución salina en blanco entre. </li><li> Coloque el estándar de 0,5 McFarland en el nefelómetro y calibrar según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5. Preparación del inóculo <ol><li> De trabajo en las colonias raspar BSC, de medio sólido con un asa estéril en el tubo debidamente etiquetado salinas entre cuentas de vidrio hasta un ≥ 0,5 McFarland estándar se obtiene. </li><li> Inspeccione visualmente la muestra, y comparar con el estándar de McFarland. </li><li> Vórtice de la muestra durante 30-60 segundos. </li><li> Deje que el inóculo que conformarse con 15 minutos (un cronómetro). </li></ol> 6. La inoculación de la placa de microtitulación <ol><li> Ajuste del inóculo con solución salina caldo entre usar el nefelómetro calibrado a la McFarland 0,5 en pasos de 4.1 y 4.2. Esto se debe completar en 30 minutos (según las especificaciones del fabricante). </li><li> Utilice una pipeta de 200 ly una punta de aerosol LARGO pipeta resistentes a eliminar 100 L de inóculo a partir de la tercera TOP 1 / 3 de la solución salina tubo de cuentas entre. Inocular el caldo Middlebrook 7H9. Poco a poco el caldo inoculado vórtice 7H9 durante 20 segundos. </li><li> Retire la placa de microtitulación AST del paquete del fabricante. No lo use si el desecante es de color azul o si el paquete de aluminio está dañado. </li><li> Preparar un tubo de dilución de 1:50 para su posterior uso en la preparación de la dilución 1:50 con la pipeta 50 l de agua estéril en un tubo estéril. </li><li> Con cuidado, vierta el caldo 7H9 inóculo en un canal. Evitar generar aerosoles. </li><li> Coloque la placa de microtitulación de AST con la etiqueta hacia usted. </li><li> Utilice una pipeta de 12 canales para añadir 100 ml de inóculo a cada pocillo. </li><li> Preparar las diluciones para el recuento de colonias: <ol type="a"><li> La dilución de 1 / 1 se prepara a partir del control positivo y (H12) por rayar un bucle l en la placa de 7H10 con la etiqueta "1.1". </li><li> La dilución 1 / 50 se prepara mediante la inoculación de un circuito de 1 l de control positivo y (H12) y girando en el tubo con 50 l de tubo de agua preparada anteriormente. Una racha de L de esta dilución a la placa "1 / 50". </li></ol></li><li> Inocular las placas de la pureza de la cubeta con la pipeta 50 L en un agar sangre debidamente etiquetados y la placa de 7H10 y raya para el aislamiento. </li><li> Lugarun sello adhesivo en la placa de microtitulación de AST. Presione con firmeza en cada pozo para asegurar estanqueidad adecuada mediante el uso de la parte posterior del blanco de la junta. Evitar las arrugas. </li><li> La desinfección de la placa de microtitulación frotándolo con una toalla de papel empapado con un desinfectante tuberculocida y placa de microtitulación en una bolsa de plástico y cierre con un sello de calor o de la cinta. <ol type="a"><li> La bolsa de plástico sirve como un contenedor secundario para asegurarse de que todos los caldos se encuentra debe haber una fuga o derrame de la placa principal. </li></ol></li></ol> 7. Desinfección de materiales y el gabinete de seguridad biológica <ol><li> Para evitar la producción de aerosoles, en otro lugar a través en la parte superior del canal inoculadas antes de colocarlo suavemente en el recipiente de descarte. </li><li> Desinfectar todos los materiales incluyendo nephlometer, vórtice, placas, tubos, etc al lavarlo con un desinfectante tuberculocida y esperar el momento adecuado para asegurar la desinfección de acuerdo a las instrucciones del fabricante antes de sacarlo del BSC. Por ejemplo, ProSpray, el desinfectante tuberculocida usamos, requiere 15 minutos para matar las micobacterias. </li><li> Coloque el recipiente de descarte en una bolsa de riesgo biológico y sellado antes de esterilizar. </li></ol> 8. Incubación <ol><li> Las placas deben ser incubadas con los medios de comunicación hacia abajo y se debe tener cuidado para evitar derrames o salpicaduras de cualquier líquido. </li><li> Incubar la placa de microtitulación AST placa, 7H10 y las placas de agar sangre en una incubadora de 35 a 37 ° C con 5-10% CO 2 con 5-10% CO 2 en el laboratorio BSL2. <ol class="lalpha"><li> En nuestro laboratorio, esto es aceptable, ya que la placa esté bien sellada y dentro de una bolsa de plástico sellada. </li></ol></li><li> No más de 2 placas de microtitulación AST se deben apilar en la incubadora de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li></ol> 9. Los resultados representativos Interpretación de los resultados: Sellado AST placas de microtitulación se pueden leer de forma manual usando un espejo como una ayuda o con un lector de placas automatizado como el Vizion (Diagnóstico TREK). Las placas pueden ser examinadas en cuanto a los 7 días después de la inoculación. Examinar los pozos de control de crecimiento en puestos de H11 y H12 para determinar si son positivos (es decir, tener un depósito de células en el fondo del pozo). Si los pozos de control de crecimiento no son positivas, reincubate la placa y volver a examinar de forma periódica (por ejemplo, el día 10, día 14) hasta los pozos de control de crecimiento son positivas. <ol type="a"><li> Espejo decía: <ol type="i"><li> Lugar cerrado AST placa de microtitulación en la plataforma; </li><li> Lea los pozos de control de crecimiento después de 7 días de incubación, cuando éste sea negativo, reincubate AST placa de microtitulación; </li><li> Si los controles de crecimiento son aceptables, a continuación, lea los pozos que contiene droga. Para cada medicamento, registrar la primera dilución que no tiene el crecimiento mediante la comparación de los pozos de drogas con el control del crecimiento. </li><li> El crecimiento se presenta como la turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pozo. </li></ol></li><li> Instrumento de lectura: seguir las instrucciones del fabricante, las instrucciones a continuación son un ejemplo de cómo la lectura se hace con la plataforma Vizion: <ol type="i"><li> Log in </li><li> Use "MYCOTB" software placa de AST. </li><li> Coloque la placa de sellado con el código de barras frente al usuario. El crecimiento se presenta como la turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pozo. </li><li> Lea controla el crecimiento, cuando éste sea negativo, reincubate AST placa de microtitulación, si es positivo leer la placa tocando la pantalla con el primer pozo de cada medicamento que no muestra crecimiento. </li></ol></li></ol> Leer las placas pureza. La placa de agar sangre no debe mostrar un crecimiento después de 48 horas y la placa de pureza 7H10 debe tener un crecimiento confluente del tipo de organismo una. Si está contaminado, la prueba de microtitulación AST debe repetirse a partir de un cultivo puro. Calcular el recuento de colonias del control positivo y utilizando la tabla siguiente: Key Colony Conde <table border="1"><tbody><tr><td> # Colonias contadas en la placa de la etiqueta "1.1" </td><td> # Colonias contadas en la placa "1 / 50" </td><td> Inóculo recuento de colonias (ufc / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 X 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 x 10 4 a 1 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 X 10 5 al 05 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> No puede ser posterior con ácido para-aminosalicílico en algunas cepas de Mycobacterium tuberculosissis. Esto puede ser interpretado por mirar a todos los pozos que tienen y el uso de pellets en el primer pozo que tiene el mismo tamaño de las pastillas como la dilución siguiente como el punto final. La resistencia es rara, con este medicamento. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los resultados representativos con la placa MYCOTB. <table border="1"><tbody><tr><td> Abreviatura de drogas </td><td> Droga </td><td> MIC μ / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacino </td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td> rifampicina </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td> amikacina </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> estreptomicina </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutina </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> p-aminosalicílico </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td> etionamida </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cicloserina </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazida </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamicina </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> etambutol </td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
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<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
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<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Un ejemplo de una placa de microtitulación AST que tiene controles de crecimiento positivo se muestra en la Figura 1 y el MIC final (g / ml) para cada droga es un círculo. Un estudio realizado en nuestro laboratorio indican que el método de la placa de microtitulación de AST es equivalente a la proporción de oro método estándar de agar para determinar la susceptibilidad de Mycobacterium tuberculosis. Más rápida presentación de los resultados se obtuvo con microtiter AST placa de microtitulación en comparación con el método de agar proporción tradicional con la interpretación final de AST microplaca y el método de proporción de agar a 14 y 21 días, respectivamente.El AST microplaca tiene la ventaja de la primera prueba y medicamentos de segunda línea al mismo tiempo que puede ayudar a prevenir demoras excesivas con cepas resistentes. La placa de microtitulación de AST es mucho más fácil de configurar y leer que la APM y los dos un espejo manual y un sistema semi-automático, como el Vizion se puede utilizar para leer las placas. La disponibilidad de un valor de MIC para probar la resistencia a los medicamentos antituberculosos pueden proporcionar información nueva y valiosa a los médicos en relación con el valor de la concentración crítica tradicional, especialmente para aquellos aislados con &quot;límite&quot; la susceptibilidad.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> AST placas de microtitulación y sello adhesivo </td><td> TREK Diagnóstico, Cleveland, Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> McFarland estándar de 0,5 </td><td> TREK Diagnóstico, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 placas </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Placas de agar sangre </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Estéril bucles l 1 </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Bucles estéril de 10 l </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween caldo de bolas de cristal </td><td> TREK Diagnóstico, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 caldo OADC </td><td> TREK Diagnóstico, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Consejos largo Pipet </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Los comederos estéril </td><td> TREK Diagnóstico, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20μL </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Consejos para 1000, 20, 20 l </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Pipeteador multicanal </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de 5-10% de CO2 </td><td> Pescador </td><td></td></tr><tr><td> Las bolsas de plástico, pequeños, CO 2 permeable </td><td> Poli de plástico, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> Desinfectante TB (tales como ProSpray C-60) </td><td> Certol Internacional, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Espejo Caja lector </td><td> Pescador </td><td></td></tr></tbody></table>

pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

La rápida detección de resistencia a los antimicrobianos es importante en el esfuerzo por controlar el aumento de la resistencia de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) de Mtb tradicionalmente ha sido realizado por el método de la proporción de agar o las pruebas macrobroth en un instrumento como el BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnóstico TREK, Cleveland, OH) o BacT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). El método de proporción de agar, mientras que considera el &quot;gold&quot; estándar de AST, es un trabajo intensivo y requiere el cálculo de la resistencia mediante la realización de recuentos de colonias en agar que contiene el fármaco en comparación con el agar libre de drogas. Si hay crecimiento de ≥ 1% en el medio que contiene el fármaco en comparación con la droga libre de soporte, el microorganismo se considera resistente a ese medicamento. Los métodos macrobroth requieren instrumentación y el punto de prueba de ruptura (&quot;crítica&quot;), las concentraciones de drogas para los medicamentos de primera línea (isoniazida, etambutol, rifampicina y pirazinamida). El método descrito aquí está comercialmente disponible en un formato de 96 pocillos de microtitulación [MYCOTB (Diagnóstico TREK)] y contiene concentraciones crecientes de 12 de los antimicrobianos utilizados para el tratamiento de la tuberculosis entre los dos primeros (isoniacida, rifampicina, etambutol) y medicamentos de segunda línea (amikacina, cicloserina, etionamida, kanamicina, moxifloxacina, ofloxacino, ácido para-aminosalicílico, la rifabutina y estreptomicina). Pirazinamida, un fármaco de primera línea, no está incluido en la placa de microtitulación, debido a su necesidad de condiciones de la prueba ácida. Ventajas del sistema de microtitulación incluyen tanto la facilidad de instalar y más rápido tiempo de vuelta (14 días) en comparación con la proporción de agar tradicional (21 días). Además, la placa se puede configurar de inóculo preparado utilizando caldo o medio sólido. Dado que el formato de placa de microtitulación es nuevo y ya Mtb presenta retos únicos de seguridad en el laboratorio, este protocolo se describe cómo configurar de forma segura, incubar y leer la placa de microtitulación.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis es difícil, pero fundamental para el cuidado del paciente. Este formato de placa de microtitulación ofrece la prueba de 12 medicamentos antimicobacterianos y proporciona la concentración inhibitoria mínima (CIM) los valores, que ayudará en el tratamiento adecuado.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

La detección rápida de la resistencia antimicrobiana es importante en el esfuerzo por controlar el incremento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) resistente. ...

Hay relativamente pocos medicamentos disponibles para tratar Mycobacterium tuberculosis, por lo que la resistencia a cualquier fármaco es motivo de preocupación. Este artículo en video describe un procedimiento para probar la resistencia antibiótica de M. tuberculosis a 12 fármacos antimicrobianos diferentes simultáneamente. Por lo tanto, la capacidad de detectar rápidamente la resistencia antimicrobiana de M. tuberculosis es muy importante en los esfuerzos por controlar el aumento de cepas resistentes. Aquí se prueba la susceptibilidad a antibióticos.M. tuberculosis se cultiva primero en medios sólidos o en caldo, obteniendo una suspensión bacteriana. Se prepara el inóculo y se añade a una placa de microtitulación que contiene diferentes concentraciones de 12 fármacos, incluyendo medicamentos de primera y segunda línea. Tras la incubación, el grado de crecimiento en cada pocillo se determina manualmente mediante una caja con espejo o utilizando un lector de placas semiautomatizado.Los datos obtenidos indican la concentración inhibitoria mínima para cada fármaco evaluado y muestran a qué antibióticos es resistente la cepa de TB analizada. Estos resultados ayudan a elegir el fármaco adecuado para el tratamiento de la TB. Hola, mi nombre es Nancy Ek y soy directora del Laboratorio de Micobacteriología en la Clínica Mayo en Rochester, Minnesota.Hoy vamos a describir un método para realizar pruebas de susceptibilidad a antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la dilución en caldo macroscópica es que se determina una CIM para cada fármaco y se prueban simultáneamente 12 antibióticos. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kurt Jude, especialista en control de calidad en mi laboratorio, trabajando en una mesa de laboratorio.Prepárese para este procedimiento etiquetando una placa de agar sangre, tres placas Middlebrooks siete H 10, un tubo de bolas de vidrio con salina Tween y una placa de microtitulación con el nombre del paciente y el número de identificación de la muestra. Además, etiquete la placa de agar sangre y las placas siete H 10 como pureza. Marque una de estas placas siete H 10 como recuento de colonias uno a uno y la otra como recuento de colonias uno a 50.Luego, coloque la bandeja en el pasamuros. A continuación, prepárese para trabajar en la instalación de nivel tres de bioseguridad BSL-3 poniéndose una bata de frente cerrado, cubierta para la cabeza, guantes, fundas para zapatos y un respirador. Aquí se utiliza un respirador PAPR.Luego retire la bandeja del paso de transferencia. A continuación, en la instalación de nivel de seguridad biológica tres, desinfecte la superficie del gabinete de seguridad biológica. Luego coloque una toalla de papel empapada con desinfectante dentro de la campana, aproximadamente a seis pulgadas del panel del ventilador de aire, junto a la toalla de papel.Coloque asas de inoculación, pipetas y puntas, un recipiente adecuado para eliminación de desechos, un nephi, TER y un vórtex. Una vez preparada la cabina, coloque el organismo sobre la toalla de papel junto con un portamatraces que contenga un patrón McFarland 0.5, caldo siete H nueve con OADC y un tubo de bolas de salina. Este montaje se realiza a partir de un medio sólido.Prepare un inóculo a partir de un cultivo en medio sólido obtenido de una muestra del paciente. Utilice un asa estéril para raspar las colonias y transfiéralas al tubo de vidrio con perlas que contiene salino Tween. Vortexe la suspensión durante 30 a 60 segundos.Inspeccione visualmente la muestra, comparándola con el estándar de McFarland. La cantidad transferida debe ser igual o mayor que la del estándar. Si no es así, agregue más de la muestra bacteriana y vortexe nuevamente.Una vez que se haya igualado con el estándar de McFarland, deje reposar el inóculo durante 15 minutos para permitir que los agregados más grandes de bacterias sedimenten. A continuación, utilice un nefi TER para ajustar a cero la densidad de las bacterias en suspensión. El nephi ter.Primero coloque un tubo en blanco con perlas de salina Tween en el Nephi ter. Presione el botón de calibración para cero el instrumento, luego coloque el estándar de McFarland 0.5 en el Nephi ter y presione el botón de calibración nuevamente. Una vez que el instrumento esté calibrado, retire el estándar de McFarland e inserte el inóculo.La lectura del inóculo debe ser igual a la lectura del estándar de McFarland. Si la lectura es demasiado baja, retire el tubo y transfiera más bacterias desde la placa. Luego, vortexe y lea la muestra nuevamente.Si la lectura es demasiado alta, agregue salina Tween al tubo y vortexee. Luego, lea la muestra nuevamente. Continúe ajustando el inóculo según sea necesario hasta que la concentración de las bacterias coincida con el estándar de McFarland.A continuación, utilice un pipeteador de 200 microlitros y una punta de pipeta larga resistente a aerosoles para extraer 100 microlitros de inóculo del tercio superior del tubo. Para evitar cualquier grumo que se esté sedimentando en el fondo, inocule lentamente el caldo Middlebrook 7H9 y vortex la mezcla inoculada durante 20 segundos para sembrar el inóculo. Comience retirando la placa de microtitulación del envase del fabricante. Si el desecante es azul o si el envoltorio de aluminio está dañado, no lo utilice.La placa ya contiene los 12 antimicrobianos que se probarán en cada pocillo, incluyendo los fármacos más efectivos o de primera línea y los de segunda línea. Vierta cuidadosamente el inóculo de caldo H nueve en un recipiente de vidrio, teniendo cuidado de no generar aerosoles. Luego, coloque la placa de microtitulación con la etiqueta hacia afuera, como se muestra aquí, y utilice un pipetador de 12 canales para añadir 100 microlitros del inóculo a cada pocillo.A continuación, prepare placas para realizar recuentos de colonias. Primero, prepare una placa sin diluir transfiriendo un asa de un microlitro de muestra desde el pocillo del control positivo a la placa H 10 etiquetada como uno a uno. Luego, use el asa para rayar la placa como se muestra aquí.A continuación, para preparar una dilución uno a 50, transfiera un asa de un microlitro desde el pocillo del control positivo y remuévala en el tubo con 50 microlitros de agua para estragar. Coloque un microlitro de esta dilución en la placa etiquetada como uno a 50. Inocule las placas de pureza pipeteando 50 microlitros del inóculo desde el trth hacia placas de agar sangre y placas 7 H 10 debidamente etiquetadas, y estrague para aislamiento.Luego, coloque otro trth encima del trth inoculado y colóquelos suavemente en el recipiente de desecho. Coloque un sello adhesivo en la placa de microtitulación. A continuación, utilizando el respaldo blanco, presione firmemente cada pocillo para asegurar un sellado adecuado, asegurándose de que no haya arrugas.Desinfecte la placa de microtitulación limpiándola con una toalla de papel empapada en un desinfectante bactericida para micobacterias. Luego, coloque la placa de microtitulación en una bolsa de plástico y ciérrela con sellado térmico. Finalmente, desinfecte todos los materiales, incluyendo el nefi, el vórtex, las placas y los tubos, limpiándolos con un desinfectante bactericida para micobacterias.Aquí se utiliza el pro spray después de que haya transcurrido suficiente tiempo para garantizar la desinfección. 15 minutos para el pro spray. Las placas se sujetan con cinta adhesiva transparente, se colocan en bolsas de plástico y los suministros sellados se retiran de la cabina de seguridad biológica y se colocan en el pasamuros.La bolsa roja de desecho se cierra y sella con una brida en este punto, luego se retira la bata, las fundas para zapatos y los guantes. Después de pasar a la sala de acceso y lavarse las manos, se retira el respirador, se desinfecta y se guarda tras volver a lavarse las manos; a continuación, se coloca una bata nueva y se abandona la suite de BSL-3. A continuación, el recipiente de desecho se autoclava.A continuación, incubar la placa de microtitulación y las siete placas H 10 y de agar sangre en posición normal en el incubador a 35-37 °C con 5-10% de CO2 en el laboratorio de nivel de seguridad biológica dos. Esto es aceptable porque la placa está bien sellada y dentro de una bolsa de plástico. El tiempo de generación de Mycobacterium tuberculosis es aproximadamente de 12 a 24 horas, por lo que transcurrirá al menos una semana antes de que se observe crecimiento, en forma de un sedimento celular en el fondo del pozo control. En el día 10, realizar una lectura manual con espejo colocando la placa sellada de microtitulación AST sobre la plataforma de la caja de espejo.Utilice una lámpara de escritorio para ayudar a visualizar el crecimiento y ajuste según sea necesario para obtener el mejor contraste. Verifique los pozos de control de crecimiento en este caso, H 11 y H 12, observando en el espejo. Si hay crecimiento, el pozo parecerá turbio o parecerá tener sedimento como se muestra aquí.Si no hay crecimiento, como se muestra en este ejemplo, el pocillo parecerá estar claro. En este caso, coloque la placa nuevamente en el incubador y continúe la incubación hasta 21 días. Para cada condición, compare el crecimiento con el control.Entonces, para cada registro de fármaco, la primera dilución que no presenta crecimiento. Esta es la concentración inhibitoria mínima o CIM del fármaco para examinar los resultados utilizando un lector automático de placas como el Vision. Comience abriendo el software Myco TB a ST plate y acceda al sistema. Coloque la placa sellada con el código de barras hacia afuera. Como se muestra aquí, el crecimiento aparece como turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pocillo en la pantalla del ordenador.Primero, examine los controles de crecimiento. Como antes. Si este es negativo para el crecimiento, coloque la placa nuevamente en el incubador durante hasta 21 días.Si esto es positivo, registre los resultados tocando el primer pocillo que no muestre crecimiento en la pantalla para cada fármaco. En algunos casos, las bacterias, el sedimento o los fármacos precipitan en el fondo del pocillo. Este fenómeno, conocido como crecimiento residual, se indica mediante varios pocillos con el mismo tamaño de pellet y no se considera realmente un crecimiento positivo.A continuación, se examinan las siete placas de H 10 y agar sangre para determinar las concentraciones bacterianas y evaluar la pureza. La placa de agar sangre no debe mostrar crecimiento tras 48 horas. El crecimiento en la placa de agar sangre indica contaminación con bacterias de rápido crecimiento.Si hay crecimiento, debe repetirse la prueba en microplaca. La placa de pureza H 10 siete debe presentar crecimiento de un solo organismo. El tipo de tuberculosis EM debe verse de color amarillo pálido, arrugado, y rugoso. Si está contaminada, debe repetirse la prueba en microplaca a partir de un cultivo puro.Para evaluar la concentración bacteriana, cuente las colonias en la placa H 10 siete. Luego, utilizando la tabla del documento escrito adjunto, calcule los conteos de colonias. Mycobacterium tuberculosis se cultivó a partir de una muestra de paciente y se evaluó la resistencia a antibióticos como se describe en este video; en la placa mostrada aquí, están presentes 12 fármacos diferentes en concentraciones crecientes, con las concentraciones más altas en la parte superior y las más bajas en la parte inferior.La concentración inhibitoria mínima, o CIM del fármaco, se indicó mediante la concentración más baja del fármaco que no mostró crecimiento alguno y está marcada con un círculo en la imagen mostrada aquí, utilizando puntos de corte estandarizados establecidos por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. Los datos mostrados aquí sugieren que esta cepa de TB será resistente a Isid y rifampicina. In vitro, las CIM elevadas observadas en varios otros fármacos, incluyendo oin, moxifloxacino, estreptomicina y rifabutina, sugieren la resistencia de la cepa de tuberculosis EM a estos agentes.Los resultados de la CMI deben ser utilizados por un especialista en enfermedades infecciosas con experiencia en el tratamiento de la tuberculosis para elaborar un plan de tratamiento individualizado. Una vez dominada, esta técnica requiere aproximadamente 40 minutos para preparar un aislado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este es un patógeno respiratorio y que, una vez que se generan aerosoles, existe un riesgo significativo. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis mediante el método de dilución en caldo microbiano. No olvides que trabajar con Mycobacterium tuberculosis puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones, como la protección respiratoria, allí donde sean requeridas.

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Investigación

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Este video muestra un ensayo en caldo para determinar la eficacia antibiótica contra Mycobacterium tuberculosis. El cultivo bacteriano se incuba con diferentes concentraciones de un antibiótico bactericida. La eficacia bactericida se mide evaluando la presencia de bacterias viables mediante un ensayo de resazurina.

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El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

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Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación (Video) | JoVE Journal

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

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