Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis complex para drogas de primera línea y la segunda por dilución en caldo en un formato de placa de microtitulación

Hay relativamente pocos medicamentos disponibles para tratar el Mycobacterium tuberculosis, por lo que la resistencia a cualquier medicamento es una preocupación. Este artículo de video describe un procedimiento para probar la resistencia a los antibióticos de M. tuberculosis a 12 medicamentos microbianos diferentes simultáneamente. Por lo tanto, la capacidad de detectar rápidamente la resistencia a los antimicrobianos de M. tuberculosis es muy importante en el esfuerzo por controlar el aumento de las cepas de resistencia para probar la susceptibilidad a los antibióticos.

La M tuberculosis se cultiva primero en medios sólidos o en caldo, una suspensión bacteriana. El inóculo se prepara y se añade a una placa de microtitulación que contiene diferentes concentraciones de 12 fármacos, incluidos los fármacos de primera y segunda línea después de la incubación. El grado de crecimiento en cada pozo se determina manualmente utilizando una caja espejo o utilizando un lector de placas semiautomático.

Los datos resultantes indican la concentración inhibitoria mínima para cada fármaco analizado y muestran a qué antibióticos es resistente la cepa de tuberculosis analizada. Estos resultados ayudan a elegir el fármaco adecuado para el tratamiento de la tuberculosis. Hola, mi nombre es Nancy Ek y soy directora del Laboratorio de Bacteriología Micológica de la Clínica Mayo en Rochester, Minnesota.

Hoy vamos a describir un método para hacer pruebas de susceptibilidad a los antibióticos para Mycobacterium tuberculosis. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la dilución en macrocaldo, es que se determina una CMI para cada fármaco y se prueban 12 antibióticos al mismo tiempo. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kurt Jude, un especialista en calidad de mi laboratorio, que trabaja en una mesa de laboratorio.

Prepárese para este procedimiento etiquetando una placa de agar sangre, tres placas Middlebrooks siete H 10, un tubo de perlas de vidrio de solución salina y una placa de microtitulación con el nombre del paciente y el número de identificación de la muestra. Además, etiquete el agar sangre y las siete placas H 10 como pureza. Marque la etiqueta de una de estas siete placas H 10 como un conteo de colonias de uno a uno y la otra como un conteo de colonias de uno a 50

A continuación, coloque la bandeja en el paso. A continuación, prepárese para trabajar en las instalaciones de bioseguridad de nivel tres BSL tres poniéndose una bata delantera sólida, guantes para la cabeza, cubrezapatos y un respirador. En este caso, se utiliza un respirador Pappa.

A continuación, recupere la bandeja de la plataforma. A continuación, en la instalación BSL tres, desinfecte la superficie de la cabina de seguridad biológica. Luego coloque una toalla de papel empapada con desinfectante dentro del capó, aproximadamente a seis pulgadas del panel de ventilación junto a la toalla de papel.

Coloque asas de inoculación, pipetas y puntas, un contenedor de eliminación de desechos apropiado, un nefi, TER y un vórtice. Una vez preparada la campana, coloque el organismo sobre la toalla de papel junto con una rejilla con un caldo McFarland 0.5 standard A seven H nine con OADC y un tubo de perlas de solución salina. Esta configuración se realiza a partir de sólido, medio.

Prepare el inóculo a partir de un cultivo medio sólido a partir de la muestra de un paciente. Use un asa estéril para raspar las colonias y transferirlas al tubo de perlas de vidrio de solución salina. Vórtice la suspensión durante 30 a 60 segundos.

Inspeccione visualmente la muestra, comparándola con el estándar de McFarland. El monto transferido debe ser igual o mayor que el estándar. De lo contrario, agregue más muestra bacteriana y vórtice. Otra vez.

Una vez que coincida con el estándar de McFarland, deje que el inóculo se asiente durante 15 minutos para permitir que se asienten grupos más grandes de bacterias. A continuación, utilice un TER nefi para medir la densidad de las bacterias suspendidas a cero. El nefi ter.

Primero coloque un tubo de interpolación de perlas de solución salina en blanco en el nefi tro, presione el botón de calibración para poner a cero el instrumento, luego coloque el estándar McFarland 0.5 en el nefi ter y presione el botón de calibrar nuevamente. Una vez calibrado el instrumento, retire el patrón McFarland e inserte el inóculo.

La lectura del inóculo debe ser igual a la lectura estándar de McFarland. Si la lectura es demasiado baja, retire el tubo y transfiera más bacterias de la placa. A continuación, vórtice y vuelva a leer la muestra.

Si la lectura es demasiado alta, agregue solución salina al vórtice del tubo. A continuación, vuelva a leer el ejemplo. Continúe ajustando el inóculo según sea necesario hasta que la concentración de las bacterias coincida con el estándar de McFarland.

A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros y una punta de pipeta larga resistente a los aerosoles para extraer 100 microlitros de inóculo del tercio superior del tubo. Para evitar cualquier grumo que se asiente en el fondo de la inoculación, el caldo Middlebrook seven H nine vórtice lentamente el caldo inoculado durante 20 segundos para colocar el inóculo Comience por quitar la placa de microtitulación del paquete del fabricante. Si el desecante es azul o si el paquete de aluminio está dañado, no lo use.

La placa ya contiene los 12 antimicrobianos que se van a probar en cada pocillo, incluidos los fármacos más eficaces o de primera línea y los fármacos de segunda línea. Vierta con cuidado el inóculo del caldo siete H nueve en un trth teniendo cuidado de no generar aerosoles. A continuación, coloque la placa de micro titulación con la etiqueta hacia afuera como se muestra aquí, y utilice una pipeta de 12 canales para añadir 100 microlitros del inóculo a cada pocillo.

A continuación, prepare las placas para realizar los recuentos de colonias. Primero, prepare una placa sin diluir transfiriendo un bucle de muestra de un microlitro desde el pocillo de control positivo a las siete placas H 10 etiquetadas uno a uno. Luego use el lazo para rayar la placa como se muestra aquí.

A continuación, para preparar una dilución de uno a 50, transfiera un bucle de un microlitro desde el pozo de control positivo y gírelo en el tubo con 50 microlitros de raya de agua. Un microlitro de esta dilución en la placa etiquetada del uno al 50. Inocular las placas de pureza pipeteando 50 microlitros del inóculo del trigésimo en agar sangre debidamente etiquetado y siete placas de H 10 y rayar para el aislamiento.

A continuación, apile otro trth encima del trth inoculado y colóquelo suavemente en el recipiente de desechos. Coloque un sello adhesivo en la placa de microtitulación. Luego, usando el respaldo blanco, presione firmemente en cada pozo para asegurar un techo adecuado, asegurándose de que no haya pliegues.

Desinfecte la placa de micro tirantes limpiándola con una toalla de papel empapada con un desinfectante cida tuberculoso. A continuación, coloque la placa de microtitulación en una bolsa de plástico y ciérrela con un termosellado. Por último, desinfecte todos los materiales, incluidos el nefi, el vórtice de litro, las placas y los tubos, limpiándolos con un desinfectante cida tuberculoso.

En este caso, el spray profesional se utiliza después de que haya pasado el tiempo suficiente para garantizar la desinfección. 15 minutos para el spray profesional. Las placas se pegan con cinta adhesiva y se colocan en bolsas de plástico y los suministros sellados se retiran del gabinete de bioseguridad y se colocan en el paso.

La bolsa roja de desecho se cierra y se sella con un lazo giratorio en este punto, se quita la bata, los botines y los guantes. Después de ir a la antesala y lavarse las manos, quítese el respirador y desinfecte y guárdelo después de lavarse las manos nuevamente, póngase una bata limpia y salga de la suite BSL three. A continuación, el contenedor de descarte se esteriliza en autoclave.

Después de esto, incube la placa de microtitulación y las siete placas H 10 y sinfín de sangre con el lado derecho hacia arriba en la incubadora de 35 a 37 grados Celsius con 5 a 10% de CO2 en el laboratorio BSL dos. Esto es aceptable porque la placa está bien sellada y en una bolsa de plástico, el tiempo de generación de mycobacterium tuberculosis es de aproximadamente 12 a 24 horas, por lo que pasará al menos una semana antes de que se pueda ver el crecimiento como la formación de una célula en la parte inferior del control. Bueno, el día 10, realice una lectura manual del espejo colocando la hoja de micro tirita ST sellada en la plataforma de la caja del espejo.

Use una lámpara de escritorio para ayudar a visualizar el ajuste de crecimiento según sea necesario para obtener el mejor contraste. Revise los pozos de control de crecimiento en este caso, H 11 y H 12 mirándose al espejo. Si hay crecimiento, el pozo aparecerá turbio o parecerá tener sedimentos como se muestra aquí.

Si no hay crecimiento como se muestra en este ejemplo, el pozo parecerá estar limpio. En este caso, vuelva a colocar la placa en la incubadora y continúe incubando hasta por 21 días. Para cada condición, compare el crecimiento con el control.

Pues bien, por cada registro de fármaco, la primera dilución que no tiene crecimiento. Esta es la concentración inhibitoria mínima, o MIC para que el medicamento examine los resultados utilizando un lector de placas automatizado, como el Vision, comience abriendo el software de placas Myco TB a ST y registre en su lugar la placa sellada con el código de barras hacia afuera. Como se muestra aquí, el crecimiento aparece como turbidez o como un depósito de células en el fondo de un pozo en la pantalla de la computadora.

Primero, examine los controles de crecimiento. Como antes. Si esto es negativo para el crecimiento, vuelva a colocar la placa en la incubadora durante un máximo de 21 días.

Si este es positivo, registre los resultados tocando el primer pocillo, que no muestra crecimiento en la pantalla para cada medicamento. En algunos casos, bacterias, sedimentos o medicamentos se precipitan al fondo del pozo. Este fenómeno, conocido como trailing, está indicado por varios pozos con pellets del mismo tamaño y en realidad no se considera crecimiento positivo.

A continuación, se examinan las siete placas de H 10 y agar sangre para determinar las concentraciones bacterianas y evaluar la pureza. La placa de agar sangre no debe mostrar crecimiento después de 48 horas. El crecimiento en la placa de agar sangre indica contaminaciones con bacterias de rápido crecimiento.

Si hay crecimiento, se debe repetir la prueba de microtitulación. La placa de pureza de siete H 10 debe tener el crecimiento de un organismo. La tuberculosis tipo EM debe aparecer de color beige, color, arrugada y áspera Si está contaminada, la prueba de microtitulación debe repetirse a partir de un cultivo puro.

Para evaluar la concentración bacteriana, cuente las colonias en la placa de siete H 10. Luego, usando la tabla en el documento escrito adjunto, calcule los recuentos de colonias. Mycobacterium tuberculosis se cultivó a partir de una muestra de paciente y se evaluó la resistencia a los antibióticos como se describe en este video en la placa que se muestra aquí, 12 medicamentos diferentes están presentes en concentraciones crecientes con las concentraciones más altas en la parte superior y las concentraciones más bajas en la parte inferior.

La concentración inhibitoria mínima, o MIC del fármaco, se indicó mediante la concentración más baja del fármaco que no mostró ningún crecimiento y se encierra en un círculo en la imagen que se muestra aquí utilizando puntos de corte estandarizados establecidos por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. Los datos que se muestran aquí sugieren que esta cepa de tuberculosis será resistente al Isid y a la rifampicina. In vitro, los micrófonos altos que se observan en varios otros fármacos, como la oína, la moxifloxacina, la estreptomicina y la rifabutina, sugieren la resistencia de la cepa de tuberculosis EM a estos agentes.

Los resultados de la CMI deben ser utilizados por un especialista en enfermedades infecciosas con experiencia en el tratamiento de la tuberculosis para desarrollar un plan de tratamiento individualizado. Una vez dominada esta técnica, se tarda unos 40 minutos en establecer un aislado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este es un patógeno respiratorio y una vez que genere aerosoles, después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar mycobacterium tuberculosis, pruebas de susceptibilidad antimicrobiana utilizando el método de dilución de micro caldo. No hay que olvidar que trabajar con mycobacterium tuberculosis puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la protección respiratoria donde se requiera.