Silenciamiento génico mediado por siRNA en células madre neurales

Tomemos como ejemplo el ARN de interferencia pequeño, o ARNip, un tipo de ARN involucrado en el silenciamiento génico.

Agregue vesículas lipídicas esféricas llamadas liposomas.

El liposoma encapsula el ARNip, protegiéndolo de la degradación.

Agregue complejos de siRNA-liposomas a un pozo de cultivo que contenga células madre neurales. Mantenga uno bien como control e incube.

El liposoma se fusiona con la membrana celular, liberando el ARNip.

El ARNip se une al complejo de silenciamiento inducido por ARN, o RISC, donde se extrae una hebra.

La hebra restante se dirige al ARNm responsable de la diferenciación celular, lo que lleva a su degradación.

Agregue un medio de diferenciación adecuado a los pocillos.

En el pozo de control, los factores de crecimiento y otros nutrientes en el medio promueven la diferenciación de las células madre neurales en osteoblastos.

Utilizando técnicas de tinción adecuadas, tiña marcadores específicos de osteoblastos en las células y tiñe el núcleo con un colorante fluorescente azul.

La ausencia de marcadores específicos de osteoblastos en las células silenciadas por genes indica su incapacidad para diferenciarse.

Para realizar la eliminación de siRNA en células O9-1, recupere y siembre las células. Diluir los liposomas en un volumen adecuado de medios sin suero. Luego, diluya el ARNip en medios sin suero de acuerdo con el protocolo de texto. Después de esto, agregue el siRNA diluido a los liposomas diluidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar la solución pipeteando e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue un volumen apropiado de complejo siRNA-lípidos a las células. Luego, incube las células durante 24 horas en una incubadora de cultivo celular estándar. Las células O9-1 pueden diferenciarse en diferentes tipos de células en condiciones específicas de cultivo de diferenciación. Para diferenciar las células O9-1 en osteoblastos, prepare medios de diferenciación osteogénicos de acuerdo con el protocolo de texto. Finalmente, detectar el marcador osteoblástico osteocalcina en osteoblastos diferenciados mediante inmunotinción.