Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la morfología detallada de las neuronas larvales de arborización dendrítica de Drosophila. Esto se logra primero recolectando embriones, envejeciéndolos y generando clones genéticos marcados con GFP mediante la expresión inducida por choque térmico de lipasa. El segundo paso consiste en seleccionar larvas con clones neuronales fluorescentes y obtener una imagen de sus arborizaciones dendríticas.

Después de obtener imágenes de la larva, se disecan, fijan y tiñen mediante inmunomarcado para que puedan montarse y se pueda visualizar, mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia, la morfología de sus arborizaciones dendríticas y terminales axónicos. Hoy demostraré un protocolo para el análisis morfológico de los órganos sensoriales periféricos inferiores sula y los exones utilizando moscas genéticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neurológico, como por ejemplo cuáles son los programas genéticos que controlan la identidad neuronal, la forma oral dendrítica y la conectividad externa.

Comience este protocolo recolectando embriones en placas con jugo de manzana. El choque térmico se aplica en un baño de agua a 38 grados Celsius, y la duración varía según la genética del embrión y el tamaño de los clones deseados. Para este protocolo, genere clones markum a partir de embriones que posean un marcador con un promotor de neuronas de arborización dendrítica pand. Antes del choque térmico, mantenga los embriones marcadores a 25 grados Celsius, rodeados de tejidos húmedos durante dos horas.

Prepare las placas de recolección para el choque térmico haciendo que sean sumergibles mediante el uso de placas vacías y parafina. Luego, someta los embriones marcadores a un choque térmico durante una hora para generar clones pequeños o la marcación de una sola neurona. Para aumentar el número de clones, utilice un choque térmico prolongado incubando durante 45 minutos en el baño, seguido de 30 minutos a temperatura ambiente y luego otros 30 minutos en el baño.

Para generar clones de recombinación, recolecte embriones durante 24 horas continuas. Este protocolo utiliza un controlador específico de clase cuatro. Somete los embriones de recombinación a un choque térmico durante una hora después del choque térmico.

Coloque las placas de recolección en una placa de Petri de 10 centímetros rodeada de tejidos húmedos y cultivo. Los embriones se mantienen a 25 grados Celsius durante el monitoreo del cultivo embrionario, y se debe reponer la pasta de levadura según sea necesario. Debido a que la nutrición afecta críticamente el desarrollo neuronal.

Mantenga el cultivo hasta que se puedan recolectar brevemente las larvas de tercer estadio en la lava estelar; enjuague suavemente las larvas de tercer estadio con agua del grifo y transfiéralas a una placa de agar. Examine ahora las larvas utilizando un microscopio de disección de fluorescencia potente y pinzas para insectos. Identifique larvas con neuronas positivas para GFP en la pared corporal y transfiéralas a una lámina de depresión con una gota de glicerol al 80 %.

Coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos para inmovilizar la larva. Asegúrese de que no quede aire entre la larva y el cubreobjetos. Utilice microscopía confocal estándar para visualizar las neuronas de interés a través de la cutícula de la larva.

Para cambiar la posición de la lava y obtener un ángulo de visión mejorado, empuje suavemente la cubreobjetivo para hacer rodar la lava. Inicie este protocolo transfiriendo una lava a la placa protectora SIL utilizando fórceps de insecto. Luego, fíjela en los extremos anterior y posterior.

Luego, agregue tampón HL 3.1 sin calcio. Ahora corte hasta la mitad en ambos extremos de la larva, perpendicularmente al eje anterior-posterior. A continuación, corte a lo largo de la línea media entre las dos tráqueas.

Corte cuidadosamente cada conexión traqueal individual con la pared corporal antes de retirar suavemente el intestino. Esto mantiene intactos los nervios segmentarios que corren entre el SNS y el SNC. Con la larva aún sujeta a la placa de protección, fíjela en paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador suave, realizando cada disección en menos de cinco minutos.

De lo contrario, las ramas de las neuronas autorizadas dendríticas comenzarán a degradarse. Después de la fijación, retire los tejidos larvales en exceso. Luego lave los filetes tres veces con PBST durante 10 minutos por cada lavado.

Después de los lavados, incubar las larvas durante 20 minutos a temperatura ambiente en la solución de bloqueo con agitación suave. Una vez completado el bloqueo, reemplazar la solución de bloqueo con la solución de anticuerpo primario. Colocar la muestra en el recipiente de plástico pequeño rodeado de tejidos húmedos e incubarla durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, continuar la incubación durante una hora adicional a temperatura ambiente.

Luego, lave el filete de lava seis veces en PBST durante 10 minutos por lavado. A continuación, agregue el anticuerpo secundario y coloque los filetes en un recipiente oscuro para evitar el fotoblanqueo del Fluor. Incube los filetes durante varias horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius, seguido de una hora a temperatura ambiente.

Finalmente, lave los filetes seis veces con PBST durante 10 minutos por lavado. Los tejidos ya están listos para ser montados. Para visualizar los terminales axónicos, simplemente monte la cutícula del filete larval hacia abajo en glicerol al 80 % sobre un portaobjetos con cavidad.

Para obtener imágenes más nítidas de las dendritas, realice un montaje permanente con cubreobjetos recubiertos con PLL. Para codificar los cubreobjetos, tome una alícuota de PLL, afora hasta 10 mililitros con agua doblemente destilada y añada 20 microlitros de Kodak photo flow.

Sumerja los cubreobjetos durante 30 minutos en la solución de PLL y séquelos al aire tras retirarlos. Luego enjuáguelos brevemente con agua y aire. Séquelos nuevamente.

Repita este proceso dos veces. A partir del baño de PLL, los portaobjetos tratados durarán aproximadamente un mes. Ahora, monte un músculo de filete larval diseccionado con el lado muscular hacia abajo en una gota de PBS sobre un portaobjeto de PLL.

El filete se adherirá rápidamente al cubreobjetos utilizando un trozo de papel de tejido. Retire tanto líquido como sea posible; sin embargo, no permita que se seque por completo. A continuación, deshidrate los filetes larvales mediante una serie de baños de etanol de 10 minutos, comenzando con etanol al 35%, seguido por 50%, luego 70%, luego 95%, luego 100% y finalmente un segundo baño con etanol al 100%.

Después de los baños de etanol, realice dos o tres baños de 10 minutos en xileno. Luego coloque una gota de DPX sobre un portaobjetos limpio y coloque cuidadosamente la cubierta sobre el DPX, llenándola con la cara hacia abajo. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad y espere un día para que el DPX se solidifique.

Antes de obtener imágenes del tejido mediante microscopía focal y en vivo, es posible capturar imágenes como esta. El arborizado completo de una neurona de arborización dendrítica de clase cuatro. Este es un acercamiento de un arborizado dendrítico de una neurona de clase tres marcada mediante IHC que ha sido fijada correctamente para preservar la morfología.

El recuadro muestra la degradación que puede ocurrir tras una disección y fijación no exitosas. Esta superposición muestra un único axón de clase cuatro en el SNC. El axón está marcado con anti GFP en verde y todos los termite de clase cuatro están contramarcados con anti CD dos en magenta.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseccionar y fijar las muestras rápidamente siguiendo los axones desde la periferia hasta el SNC. Es útil tener en cuenta que las neuronas del SNP en cada segmento corporal proyectan al segmento correspondiente del cordón nervioso ventral. Además, si solo se desea visualizar las dendritas, elimine las CNAs durante la disección, y la tinción puede realizarse en tubos en lugar de en placas.

Al montar estos filetes para la imagen de dendritas, primero corte la cabeza con los ganchos bucales y la parte posterior con las espículas. Para una preparación adecuada.