Aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón en el mesencéfalo

Tome tejido del piso del mesencéfalo aislado de la región ventral del mesencéfalo de embriones de ratón.

El tejido es rico en neuronas de dopamina en desarrollo, que liberan el neurotransmisor dopamina.

Agregue una solución enzimática para descomponer la matriz del tejido, aflojando así las células.

Agregue una solución de suero que contenga ADNasa I y disocie mecánicamente el tejido digerido para generar una suspensión celular. Las proteínas séricas inhiben las enzimas, mientras que la ADNasa I degrada el ADN extracelular liberado durante la lisis celular, evitando la aglomeración celular.

Deje que los restos de tejido se asienten y transfiera las células suspendidas a un tubo nuevo.

Centrifugar y eliminar el sobrenadante, luego volver a suspender las células en un medio neuronal de dopamina o DPM.

Tome una microplaca recubierta con un sustrato de cultivo celular en el centro de los pocillos, creando microislas.

Transfiera las células al centro de las microislas para cultivarlas a alta densidad.

Incubar, permitiendo que las células se adhieran a las microislas.

Llene los pocillos con DPM e incube, facilitando el crecimiento de las neuronas de dopamina.

Para configurar cultivos embrionarios primarios del mesencéfalo a partir de embriones de ratón embrionarios de ratón del día 13,5, reúna todos los pisos del mesencéfalo recolectados en el mismo tubo de 1,5 mililitros y lave las muestras tres veces, con 500 microlitros de HBSS sin calcio y magnesio por lavado. Después del último lavado, reemplace el HBSS con tripsina al 0,5% para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, agregue 500 microlitros de una DNasa I recién preparada en solución FBS al tejido parcialmente digerido y use una pipeta de vidrio siliconado con una punta pulida al fuego para triturar el tejido. Cuando solo se puedan observar partículas diminutas y apenas visibles, permita que estos fragmentos de tejido se asienten en el fondo del tubo de microcentrífuga y transfiera el sobrenadante a un tubo cónico vacío de polipropileno de 15 mililitros.

Agregue un mililitro de HBSS al tubo que contiene DNasa I en FBS y mezcle varias veces mediante pipeteo. Transfiera un mililitro de esta solución a las partículas de tejido restantes y triture las muestras nuevamente. Luego, agrupe la suspensión celular digerida con el tubo de sobrenadante sin transferir los fragmentos de tejido restantes. Después de triturar la muestra de tejido una vez más con la DNasa I restante en FBS en HBS, sedimente las células recolectadas por centrifugación y aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento.

Lave las células dos veces en dos mililitros de medio neuronal de dopamina calentado por lavado y vuelva a suspender las células a 3 x 10⁴ células por seis microlitros de concentración de medio fresco y tibio en un tubo de microcentrífuga. A continuación, retire el medio de cada microisla previamente preparada y mezcle las células con un pipeteo suave antes de utilizar una pipeta de 10 microlitros para añadir seis microlitros de células a cada microisla.

Cuando se hayan agregado todas las células, llene los pocillos vacíos en los bordes de la placa con 150 microlitros de agua o PBS y coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante una hora. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de medio neuronal de dopamina fresco a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora.