Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en células progenitoras neurales

Tome una microplaca que contenga un cultivo adherente de fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, en un medio.

Los MEF adheridos funcionan como una capa alimentadora, proporcionando un microambiente de cultivo celular de apoyo.

Retire el medio e introduzca células madre pluripotentes inducidas humanas, o hiPSC, en un medio hiPSC complementado con pequeñas moléculas que mejoran la supervivencia celular.

Incubar para permitir que las hiPSC se adhieran a la capa alimentadora, que secreta factores de crecimiento que facilitan la proliferación de hiPSC.

Retire el medio y agregue una solución enzimática para separar las células. Transfiera las células y centrítelas, luego retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlas en el medio hiPSC.

Transfiera las células a una placa recubierta de biopolímero. Incubar para permitir que los MEF se adhieran.

Transfiera las hiPSC suspendidas a una microplaca de fondo en V. Centrifugar las células e incubarlas, induciendo la formación de agregados celulares.

Reponer con un medio de diferenciación. Los nutrientes del medio y las interacciones célula-célula dentro del agregado facilitan la diferenciación de hiPSC en células progenitoras neurales.

Para este protocolo, comience con el establecimiento de células alimentadoras. Para establecer este cultivo, coloque 600,000 células alimentadoras en cada pocillo de una placa de seis pocillos, con 300 mililitros de medio por pocillo. Después de cultivar las células alimentadoras durante 48 horas, reemplace el medio e incube las placas durante una hora, mientras prepara las células madre.

Descongele las células madre en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongeladas, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y llene el tubo a 5 mililitros con medio de cultivo, agregado gota a gota. A continuación, centrifuga suavemente las células durante cuatro minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el sedimento en 1 mililitro de medio de células madre con inhibidor de ROCK.

Después de cuantificar la densidad celular, coloque 300,000 células madre en las células alimentadoras. Luego, crezca y amplíe los cultivos, seleccionando periódicamente células sanas. Después de expandir y congelar las células como respaldo, cultive las colonias de células madre en placas estándar hasta que alcancen una confluencia del 50% al 70%.

A continuación, utilice un tratamiento enzimático suave y una titulación suave con una punta de pipeta de 1 mililitro para cosechar las HIPSC para la diferenciación de las células precursoras neurales. Centrifugue suavemente la suspensión, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en medio iPSC humano de 5 mililitros. Luego, transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 5 centímetros recubierta de gelatina al 0,1% e incube la placa durante una hora.

Después de una hora, transfiera las células no adherentes a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Luego, enjuague suavemente la placa con 3 mililitros de medio y transfiérala al mismo tubo. A continuación, repita el paso de resuspensión con una centrifugación suave.

Luego, determine la densidad celular y coloque las celdas en una placa de fondo en V de 96 pocillos y baja adhesión a 9,000 celdas por pocillo. Ahora, gire la placa durante tres minutos y comience a cultivar las células. Durante los próximos 14 días, cada dos días, reemplace la mitad del medio por uno medio diferenciador fresco.