Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar plasmodium, fpar y parásitos que se unan a células endoteliales cerebrales humanas. Esto se logra primero incubando un cultivo de plasmodium, fpar y parásitos, que contiene una mezcla de glóbulos rojos infectados y no infectados, junto con una capa de células endoteliales cerebrales humanas. El siguiente paso consiste en lavar y eliminar los glóbulos rojos no infectados y no unidos mediante varias lavadas con medio de cultivo. Luego se añaden glóbulos rojos frescos para permitir el crecimiento adicional de la población de parásitos.

La etapa final, unas semanas después, consiste en repetir la selección general tan pronto como se alcance una parasitemia suficiente. En última instancia, se utiliza microscopía para mostrar una gran cantidad de parásitos unidos a HBE cinco i. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la malaria cerebral, como la identificación de ligandos del parásito o moléculas receptoras del huésped implicadas en el proceso de citoadherencia.

Prepare glóbulos rojos humanos a partir de sangre completa grupo O positivo separando los glóbulos rojos de los glóbulos blancos mediante el paso a través de un filtro de depleción de leucocitos. Centrifugue las células a 1000 G durante 10 minutos y resuspenda el sedimento con todo el PMI. Medio incompleto.

Repita este paso de lavado una vez más, luego re suspenda el pellet. En nuestro medio PMI incompleto al 50 % de hematocrito, los glóbulos rojos se almacenan a cuatro grados Celsius durante una semana. Cultive glóbulos rojos infectados con Odium Valspar.

Con medio RPMI completo al 2 % de hematocrito e incubar a 37 grados Celsius con 3 % de dióxido de carbono, 1 % de oxígeno y 96 % de nitrógeno cada día. Realice una extensión de sangre para evaluar la etapa de desarrollo de los parásitos. Cambie el medio diariamente centrifugando el cultivo a 500 ×g durante cinco minutos.

Aspirar el sobrenadante y agregar medio RPMI completo fresco aproximadamente una vez por semana. Sincronizar los parásitos mediante tratamiento con sorbitol acuoso al 5%. El ensayo de selección puede realizarse al día siguiente de un cultivo en estadio anillo cuando se observe un mínimo de 5% a 10% de parásitos.

Además, se necesita suficiente cultivo de parásitos para formar un volumen de células P de 30 microlitros por cada placa de 60 milímetros de células hbe cinco ojo. Prepare una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros para recibir la línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro humano o H de vuelta cinco i, añadiendo dos microgramos por centímetro cuadrado de fibronectina y solución salina estéril a la placa.

Incubar la placa a 37 grados Celsius durante cinco a 20 minutos, luego aspirar la solución de fibronectina. A continuación, cosechar las células HBE cinco I de un frasco de tejido de 25 centímetros cuadrados mediante ionización y centrifugación Reese, suspender el sedimento celular en 10 mililitros de DMEM, medio completo. Luego, añadir 1,5 mililitros de esta suspensión celular a la placa de cultivo de tejidos tratada con fibronectina e incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a tres días hasta que el cultivo alcance una confluencia del 50 al 100% y los cultivos de parásitos estén listos para citoaian en el día del ensayo.

El cultivo de HBE cinco I debe estar entre 50 y 100 % de confluencia. Mientras tanto, el cultivo de parásitos debe encontrarse en la etapa de trofozoítos pigmentados, con al menos entre 5 y 10 % de parásitos y 2 % de hematocrito. Primero, pipetee 1,5 mililitros de cultivo de parásitos del frasco de cultivo y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros.

Centrifugar el cultivo a 500 G durante cinco minutos y resuspender en 10 mililitros de medio DMEM incompleto, recién preparado y tibio. Repetir este paso de lavado una segunda vez tras completar la centrifugación final.

Resuspenda el precipitado de 30 microlitros en 1,5 mililitros de DMEM incompleto. Medio incompleto suplementado con 1 % de BSA. A continuación, recupere la placa de 60 milímetros de hvac.Five.

Las células oculares aspiran el medio de cultivo y lavan dos veces con tres mililitros de DMEM. Medio incompleto. Añada la solución de parásitos, la placa de HPE cinco células oculares e incube en la incubadora de cultivo de tejidos durante 75 minutos en total.

Dos veces durante la incubación, suspenda los parásitos agitando suavemente y girando el recipiente tras la incubación. Lave el recipiente cinco veces aspirando el medio mediante una pipeta de plástico tipo espagueti para añadir tres mililitros de medio DMEM incompleto tibio, y luego agite suavemente la placa tras el lavado final; examine el recipiente bajo un microscopio invertido. Si aún se observan muchas células rojas no infectadas, repita el procedimiento de lavado tal como se describió anteriormente para eliminarlas.

Después de aspirar el medio del recipiente, resuspenda 40 microlitros de volumen celular empaquetado de glóbulos rojos frescos en medio RPMI completo tibio y agregue la suspensión celular al recipiente. Coloque el recipiente en una cámara de incubación con flujo de aire. Luego, burbujee el recipiente con 3% de dióxido de carbono, 1% de oxígeno y 96% de nitrógeno durante tres minutos.

Y coloque la cámara en un incubador a 37 grados Celsius durante la noche. Durante esta incubación, los parásitos en estadio de esquizonte estallan y los merozoítos reinfectan los glóbulos rojos. Al día siguiente, recolecte los parásitos en estadio de anillo mediante lavado.

Con medio RPMI incompleto de manera similar a como se hizo anteriormente, pero con una pipetación más enérgica del medio y agitación de la placa. Conservar todo el medio utilizado, que contendrá los glóbulos rojos resuspendidos, en un tubo cónico de 15 mililitros. Examinar la placa bajo un microscopio invertido para asegurarse de que todos los glóbulos rojos han sido eliminados del recipiente antes de la centrifugación.

El tubo que contiene el medio de la placa lavada se centrifuga para obtener el sedimento de parásitos; deseche el sobrenadante y resuspenda en cinco mililitros de medio RPMI completo. Coloque la mezcla en un matraz de 25 centímetros cuadrados para el cultivo. Los parásitos se cultivan durante dos a cuatro semanas hasta obtener suficiente material y poder realizar una nueva ronda de selección.

Los parásitos HB tres no seleccionados muestran un bajo nivel de unión a las células endoteliales hbe cinco. Esta imagen muestra células hbe cinco fijadas con glutaraldehído al 2% y teñidas con Giemsa, visualizadas bajo el microscopio con un aumento de 1000 veces. Las imágenes se tomaron después de lavar los glóbulos rojos no infectados y los glóbulos rojos infectados no unidos. Después de cada ronda de selección, un número cada vez mayor de parásitos se une a las células endoteliales, y las selecciones pueden repetirse a intervalos de tiempo más cortos tras cinco rondas de selección.

Se obtienen poblaciones de parásitos de alta unión como se muestra aquí con los parásitos HB tres HBE. Esta tabla muestra un resumen de las cepas de plasmodium alspar que se seleccionaron con éxito para unirse a HE cinco. Observo que HB tres también se seleccionó en HE cinco activado con TNF tras cinco rondas de selección.

La cepa DD dos no mostró un aumento en la unión a HBE cinco I en comparación con la DD dos no seleccionada. Esta imagen con un aumento de 400 veces muestra la unión de parásitos plasmodium alspar HB tres a células endoteliales dérmicas HD MEK antes de la selección. Aquí se muestra la unión de parásitos plasmodium alspar HB tres a la misma línea celular endotelial dérmica después de cuatro rondas de selección.

Esta figura muestra la unión de los parásitos de Plasmodium spar HB tres a células endoteliales pulmonares HP ME antes de la selección. Ahora, la unión de los parásitos de Plasmodium spar HB tres a las células HP ME aumenta después de cuatro rondas de selección. Aunque el medio de cultivo para hd e, C y HP EC difiere ligeramente, el protocolo utilizado para la selección fue idéntico al de hbe cinco I. Tras este procedimiento, se pueden realizar métodos como R-T-P-C-R o microanálisis para responder preguntas adicionales, como caracterizar la transcripción del antígeno de superficie variable en parásitos no seleccionados y seleccionados.