Name: Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende a seleccionar Plasmodium falciparum para unirse a células endoteliales cerebrales humanas mediante incubación y lavados. Este modelo in vitro facilita el estudio de la sequestración en malaria cerebral y la identificación de dianas terapéuticas.

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Agradecemos a Francisco Candal, CDC Oficina de Transferencia de Tecnología, Georgia Atlanta para HBEC-5i células. Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust (4 años las becas para estudios de doctorado a la CA y la Beca Superior en Ciencias Biomédicas Básicas de JAR, número de concesión 084226).

Recomendaciones generales Microvascular cerebro humano las células endoteliales (HBEC-5i) la cultura se ha descrito anteriormente en 6, 8. P. los parásitos P. falciparum fueron cultivadas como en 9. Ambos HBEC-5i y P. falciparum parásito culturas deben mantenerse en condiciones estériles en todo momento. Todos los reactivos deben ser pre-calentado a 37 ° C. Se recomienda comprobar regularmente la contaminación por micoplasma 10 por PCR (Minevera Biolabs, las instrucciones del fabricante siguiente). El protocolo se resume en la figura 1. 1. De las células endoteliales cultivo de rutina <ol><li> Preparar los reactivos necesarios. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio para preparar </td><td> Reactivos </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> "Incompleta DMEM" </td><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Ynbsp; </td><td> L-glutamina 200 mM </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicilina / estreptomicina 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (ajustar el pH a 7.4) </td></tr><tr><td> "DMEM completo" </td><td> "Incompleta DMEM" </td><td> 450 ml </td></tr><tr><td></td><td> Suero bovino fetal inactivado por calor </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> De las células endoteliales suplemento de crecimiento </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura HBEC-5i en un respiradero de 25cm 2 frasco con 10 ml de medio DMEM completo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Las células de paso cuando se hacen confluentes. Eliminar el medio de edad por succión y lavar dos veces con medio DMEM incompleto o cultivo de tejidos de grado PBS (Ca 2 + y Mg 2 + libre) pre-calentado a 37 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de pre-calentado TratePSIN-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA) en forma de remolino para cubrir la totalidad del frasco y se incuba durante ~ 2 min a 37 ° C. </li><li> Revisar bajo microscopio invertido al menos el 90% de las células se han separado. Si es necesario, suavemente golpee el fondo del frasco para desprender las células adherentes. Añadir 10 ml de medio DMEM completo para bloquear las células tripsina y la transferencia en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar durante 4 min a 300 g, a temperatura ambiente (TA). </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 10 ml de medio DMEM completo. Pipeta la solución de arriba y abajo para volver a suspender completamente las células. </li><li> Agregar 1 o 2 ml de la suspensión de células en un frasco de cultivo nuevo y añadir 8 ml de medio fresco para mantener la cultura. Evaluar el crecimiento de la cultura todos los días bajo un microscopio invertido y el cambio medio de cada 2 o 3 días antes de que se vuelve amarillo. </li></ol> 2. Preparación de las células endoteliales para una selección <ol><li> Dos días antes del día de la selectio n, añade fibronectina diluido en PBS estéril (2 mg / cm 2) en una (o más) 60 mm placa de Petri. Incubar la placa durante 5 a 20 min a 37 ° C, extraer la solución de fibronectina, que pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un mes y volver a utilizarse una vez. </li><li> Las células de paso como se describe en las secciones 1.3. a 1,5. Asumiendo el 100% de células confluentes se separaron y se resuspendieron en 10 ml de medio DMEM completo (sección 1.6., Volver a suspender con un volumen equivalente de medio si la confluencia es menor, por ejemplo, volver a suspender con 8 ml si la confluencia fue del 80%), añadir 1,5 ml de la suspensión las células a la placa recubierta de fibronectina Petri y otro 1,5 ml de medio DMEM completo. </li><li> Coloque el plato de Petri sembradas en la incubadora. Nota: Lo ideal sería que la confluencia será de alrededor de 90% en el momento de la selección de dos días más tarde. </li><li> Opcional. Para activar HBEC-5i, agregue el TNF (Factor de Necrosis Tumoral) de citoquinas a una concentración final de 50μg/ml 24 horas antes de la selección. </li></ol>e_title "&gt; 3. Plasmodium falciparum cultivo de rutina <ol><li> Preparar los reactivos necesarios (ver tabla aquí debajo). Prepare los glóbulos rojos (GR) por la separación de sangre total (grupo O +) por el paso a través de un filtro de los leucocitos (véase "Métodos de Investigación de Paludismo", la publicación 11 de la malaria en general el cultivo de parásitos). Lavar dos veces al RBC por centrifugación a 400 g durante 5 minutos y resuspender con 10 ml de RPMI incompleto. Mantenga lava RBC a 4 ° C en medio incompleto el 50% de hematocrito. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio para preparar </td><td> Reactivos </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> "Incompleta RPMI" </td><td> RPMI 1640 (con bicarbonato) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucosa al 20% </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> L-glutamina 200 mM <td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (ajustar el pH a 7.2) </td></tr><tr><td> "RPMI completo" </td><td> "Incompleta RPMI" </td><td> 450 ml </td></tr><tr><td></td><td> Humano agrupado (no inmunes) de suero </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultivo de P. falciparum infectados RBC con medio RPMI completo en el 2% de hematocrito y se incuba a 37 ° C con el 3% de CO 2, 1% O 2, y 96% N 2. Realizar frotis de Giemsa 11 todos los días para evaluar el grado de desarrollo de los parásitos (Figura 2). </li><li> Regularmente (aproximadamente una vez por semana) sincronizar la cultura por el tratamiento de sorbitol 12. El día antes de la selección del ensayo, el objetivo de una cultura de anillo etapa en 5% de parasitemia o más (lo ideal es por lo menos 10%). </li></ol> 4. Selección de P. falciparum de cytoadhesion a las células endoteliales <ol><li> En el día de la prueba, el cultivo de parásitos deben estar en fase de trofozoito pigmentados (Figura 2) (idealmente parasitemia 10%), mientras que HBEC-5i la cultura debe ser de 50 a 100% de confluencia (idealmente 90%). 30μl volumen celular de cultivo de parásitos que se necesita por HBEC-5i placa de Petri. </li><li> Lavar dos veces los parásitos por centrifugación (500 g por 5 min) 1,5 ml de cultivo de parásitos. Desechar el sobrenadante y resuspender con 10 ml de recién hecho, caliente, medio DMEM incompleto. Repetir el lavado por segunda vez. Resuspender el 30μl volumen celular con 1,5 ml de incompleta con BSA al 1% DMEM. </li><li> Lavar el plato recubierto HBEC-5i Petri doble aspiración de mediano y agregar 3 ml de DMEM incompleto. </li><li> Añadir la solución de los parásitos al plato HBEC-5i y se incuba a 37 ° C durante 75 min. Resuspender los parásitos en dos ocasiones (después de 30 y 60 minutos) durante la incubaciónmoviendo suavemente el plato en las cuatro direcciones, así como las agujas del reloj y en sentido contrario. </li><li> Después de la incubación, lavar el plato cinco veces por medio de aspiración, utilizando una pipeta de plástico Pasteur para añadir 3 ml de medio DMEM incompleto cálido y suave balanceo. Si los platos se están usando, guárdelas en una superficie caliente, como un frasco lleno de agua a 37 ° C. </li><li> Revise el plato bajo un microscopio invertido. Si muchos no infectada RBC son todavía visibles, hacer más lavados como se describió anteriormente. Manejar la placa de Petri con mucho cuidado para evitar cualquier riesgo de contaminación. </li><li> Quitar medio del plato y añadir 3 ml de agua tibia medio RPMI completo con un volumen de 40μl hematocrito de uRBC fresco. </li><li> Coloque el plato en una cámara hermética de incubación, gas, durante 3 minutos y colocar la cámara en una incubadora a 37 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, la cosecha de los parásitos mediante el lavado con medio RPMI incompleto, de un modo similar al descrito en la sección 4.4. pero con más fuerza. Keep todos los medio de comunicación utilizado (que contiene resuspendido RBC) en un tubo cónico de 15 ml. Revisar bajo microscopio invertido que todos los glóbulos rojos se han eliminado de la antena. </li><li> Se precipitan los parásitos, descartar el sobrenadante, resuspender en 5 ml de medio RPMI completo y colocar la mezcla en un frasco de cultivo normal. </li></ol> 5. Resultados representante Parásitos no seleccionados muestran un bajo nivel de la unión a HBEC-5i (Figura 3). Así, después de la primera ronda de selección, muy pocos parásitos serán cosechados y puede tomar hasta un mes de cultivo para llegar a una parasitemia suficiente para la segunda ronda de selección. Después de cada ronda de selección, los parásitos más y más se unen a las células endoteliales y las selecciones se pueden repetir a intervalos de tiempo más corto. Después de 4-5 rondas de selección, de alta vinculante poblaciones de parásitos se obtienen (Figura 3). En nuestras manos, la unión de HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF activa HBEC-5i fue de simnivel de ILAR (datos no mostrados). El protocolo descrito aquí se ha probado con 4 P. falciparum cepas: HB3, IT/FCR3, 3D7 y Dd2 (Tabla 1). Sólo este último no se ha demostrado capaz de unirse a HBEC-5i, incluso después de 5 rondas de selección. HB3 parásitos también fueron seleccionados para cytoadherence a dérmicos humanos y pulmonar células endoteliales microvasculares (HDMEC y HPMEC). Después de cuatro rondas de selección, utilizando el método descrito aquí, una población de alto vinculante se obtuvo en ambos HDMEC y HPMEC (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Descripción general del proceso de selección. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Etapas de desarrollo de P. falciparum infectados glóbulos rojos. Frotis de Giemsa visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un ejemplo típico de los parásitos unión a HBEC-5i. (A) La capa azul es HBEC-5i fija con glutaraldehído y se tiñeron con Giemsa, visualizaron bajo microscopio con un aumento de 1000X. Fotografías fueron tomadas después de uRBC y iRBC consolidados fueron arrasadas. El panel izquierdo muestra una sola P. falciparum HB3 (no seleccionado) parásito obligado a HBEC-5i. En el panel derecho de los parásitos HB3-HBEC había sido seleccionado por 5 rondas. (B) Los datos representan el promedio de dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El número de parásitos obligados por las células endoteliales se había contado. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Resumen de Plasmodium falciparum cepas que se han seleccionado con éxito por la unión a HBEC-5i. Tenga en cuenta que HB3 también fue seleccionado en el TNF-activa HBCE-5i. Después de 5 rondas de selección, la cepa Dd2 no mostró ningún aumento en la unión a HBEC-5i en comparación con el no seleccionado-Dd2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. La unión de P. falciparum HB3 parásitos dérmicos (HDMEC) y pulmonar (HPMEC) las células endoteliales, antes y después de cuatro rondas de selección. pesar de que el medio de cultivo para HDMEC y HPMEC difiere ligeramente (ver instrucciones del proveedor), el protocolo utilizado para la selección es idéntico al igual que con HBEC-5i. Las imágenes tomadas con una ampliación de 400X. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM-F12 de Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> L-glutamina 200 mM </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Por medio DMEM y RPMI completo </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina 100X (10.000 unidades / ml y 10mg/ml) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal inactivado por calor </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,025% de tripsina, 0,5 mM EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> De las células endoteliales suplemento de crecimiento </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Por medio DMEM completo </td></tr><tr><td> El cultivo de tejidos tratados 60 mm X 15 mm cajas de Petri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectina humana </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> El uso de 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> I +D Systems </td><td> 210-TA </td><td> opcional, el uso de 50 mg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167F </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> Be17-737E </td><td> Por medio RPMI completo </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> La línea celular primaria </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> La línea celular primaria </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Se obtiene de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Materiales

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li>
<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El sello distintivo de la malaria cerebral es la retención de P. falciparum iRBC dentro del cerebro microvasculatura 2, 3. Sin embargo, en cultivos in vitro de P. falciparum sólo poco a cytoadhere HBEC-5i, un modelo para el endotelio microvascular cerebro humano. Aquí hemos desarrollado un ensayo sencillo para enriquecer a una población de la unión a HBEC-5i, uno más &quot;in-vivo como&quot; fenotipo. Tres de cada 4 P. cepas de P. falciparum se han seleccionado con éxito utilizando este método. Además, HB3 también fue seleccionado en HDMEC y HPMEC, lo que indica que este protocolo se puede utilizar para los parásitos y diversos tipos de células endoteliales. Diferentes hipótesis pueden explicar la falta de unión con la cepa Dd2. La más probable es que el hecho de que esta línea parásito sin botón, lo que impide la profunda cytoadherence 13, 14. Se recomienda el cultivo de parásitos seleccionados junto a la selección de proproceso para proporcionar un control de comparación. Esto permitirá, por ejemplo, comparar el transcriptoma de los parásitos vinculantes y no vinculantes, con la esperanza de descubrir los candidatos parásito ligando. TNF es una citocina encontrado a un alto nivel en los pacientes con paludismo cerebral y ha sido mostrar a inducir la expresión de proteínas de la superficie muchos de HBEC-5i (Claessens et al, en preparación y 8, 15, 16). En este caso, la cantidad de iRBC obligado fue similar en condiciones normales HBEC-5i en comparación con el activo HBEC-5i. Este &quot;modelo de secuestro&quot;, también se puede utilizar para estudiar la interacción molecular entre el iRBC y las células endoteliales, así como el efecto de la supuesta cytoadherence anti-drogas. En este caso, se recomienda placas HBEC-5i en pequeños pozos, tales como la &quot;cámara de diapositivas de 8 pocillos&quot; (BD 354 628) o &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selección de plasmodium falciparum los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

La mayoría de las muertes por malaria humana es causada por el Plasmodium estadio en sangre los parásitos P. falciparum. La malaria cerebral, la complicación más mortal de la enfermedad, se caracteriza por una acumulación de Plasmodium falciparum los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la etapa de trofozoíto pigmentadas en la microvasculatura del cerebro 2-4. Esta obstrucción microvascular (secuestro) conduce a la acidosis, la hipoxia y perjudiciales citoquinas inflamatorias (revisado en 5). El secuestro también se encuentra en la mayoría de los tejidos microvascular del cuerpo humano 2, 3. El mecanismo por el cual iRBC adhieren a las paredes de los vasos sanguíneos aún es poco conocido. La línea inmortalizada Humanos microvascular cerebral de células endoteliales (HBEC-5i) ha sido utilizado como un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro 6. Sin embargo, el Plasmodium falciparum iRBC adjuntar sólo poco a HBEC-5i in vitro, a diferencia de la densa sequestrationes que se produce en los casos de malaria cerebral. Por lo tanto, desarrolló un ensayo panorámico para seleccionar (enriquecer) varias P. falciparum cepas para la adhesión a HBEC-5i para obtener poblaciones de alto vinculante parásitos, más representativo de lo que ocurre in vivo. Una muestra de un cultivo de parásitos (mezcla de iRBC y no infectados RBC) en la fase de trofozoito pigmentadas se lava y se incubaron en una capa de HBEC-5i cultivadas en una placa de Petri. Después de la incubación, el plato está cuidadosamente lavados de uRBC iRBC y no consolidados. Fresco uRBC se añaden a la iRBC pocas condiciones para HBEC-5i y se incubaron durante la noche. Como los parásitos esquizonte etapa explosión, merozoitos reinvade RBC y los parásitos en el estadio de anillo se cosechan al día siguiente. Los parásitos se cultivan hasta que se obtiene material suficiente (generalmente de 2 a 4 semanas) y una nueva ronda de selección se puede realizar. Dependiendo de la P. falciparum cepa, de 4 a 7 rondas de selección son necesarios para obtener una poblacióndonde la mayoría de los parásitos se unen a HBEC-5i. El fenotipo de la unión se pierde progresivamente a las pocas semanas, lo que indica un cambio en la expresión del gen del antígeno de superficie variante, por lo tanto la selección regular de HBEC-5i es necesaria para mantener el fenotipo. En resumen, hemos desarrollado un ensayo de selección de la representación P. falciparum parásitos más &quot;adhesivo malaria cerebral&quot; fenotipo. Hemos sido capaces de seleccionar 3 de cada 4 P. falciparum cepas de HBEC-5i. Este ensayo también ha sido utilizado con éxito para seleccionar los parásitos de la unión a las células endoteliales humanas dérmicas y pulmonares. Es importante destacar que este método puede ser usado para seleccionar tejidos específicos poblaciones de parásitos a fin de identificar ligandos candidato parásito para la unión al endotelio cerebral. Por otra parte, este ensayo puede ser utilizado para detectar el supuesto secuestro de medicamentos anti-7.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el secuestro de la malaria cerebral se describe<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los glóbulos rojos infectados son seleccionados para unirse al inmortalizado células del cerebro humano endoteliales microvasculares. Los parásitos seleccionados muestran un fenotipo distinto. El proceso de selección pueden ser aplicados utilizando diversos<em&gt; P. falciparum</em&gt; Cepas y líneas de células endoteliales.

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

La mayoría de las muertes por malaria humana son causadas por parásitos de *Plasmodium falciparum* en estadio sanguíneo. La malaria cerebral, la complicación más potencialmente mortal de la ...

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar plasmodium, fpar y parásitos que se unan a células endoteliales cerebrales humanas. Esto se logra primero incubando un cultivo de plasmodium, fpar y parásitos, que contiene una mezcla de glóbulos rojos infectados y no infectados, junto con una capa de células endoteliales cerebrales humanas. El siguiente paso consiste en lavar y eliminar los glóbulos rojos no infectados y no unidos mediante varias lavadas con medio de cultivo. Luego se añaden glóbulos rojos frescos para permitir el crecimiento adicional de la población de parásitos.La etapa final, unas semanas después, consiste en repetir la selección general tan pronto como se alcance una parasitemia suficiente. En última instancia, se utiliza microscopía para mostrar una gran cantidad de parásitos unidos a HBE cinco i. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la malaria cerebral, como la identificación de ligandos del parásito o moléculas receptoras del huésped implicadas en el proceso de citoadherencia.Prepare glóbulos rojos humanos a partir de sangre completa grupo O positivo separando los glóbulos rojos de los glóbulos blancos mediante el paso a través de un filtro de depleción de leucocitos. Centrifugue las células a 1000 G durante 10 minutos y resuspenda el sedimento con todo el PMI. Medio incompleto.Repita este paso de lavado una vez más, luego re suspenda el pellet. En nuestro medio PMI incompleto al 50 % de hematocrito, los glóbulos rojos se almacenan a cuatro grados Celsius durante una semana. Cultive glóbulos rojos infectados con Odium Valspar.Con medio RPMI completo al 2 % de hematocrito e incubar a 37 grados Celsius con 3 % de dióxido de carbono, 1 % de oxígeno y 96 % de nitrógeno cada día. Realice una extensión de sangre para evaluar la etapa de desarrollo de los parásitos. Cambie el medio diariamente centrifugando el cultivo a 500 ×g durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante y agregar medio RPMI completo fresco aproximadamente una vez por semana. Sincronizar los parásitos mediante tratamiento con sorbitol acuoso al 5%. El ensayo de selección puede realizarse al día siguiente de un cultivo en estadio anillo cuando se observe un mínimo de 5% a 10% de parásitos.Además, se necesita suficiente cultivo de parásitos para formar un volumen de células P de 30 microlitros por cada placa de 60 milímetros de células hbe cinco ojo. Prepare una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros para recibir la línea celular de células endoteliales microvasculares del cerebro humano o H de vuelta cinco i, añadiendo dos microgramos por centímetro cuadrado de fibronectina y solución salina estéril a la placa.Incubar la placa a 37 grados Celsius durante cinco a 20 minutos, luego aspirar la solución de fibronectina. A continuación, cosechar las células HBE cinco I de un frasco de tejido de 25 centímetros cuadrados mediante ionización y centrifugación Reese, suspender el sedimento celular en 10 mililitros de DMEM, medio completo. Luego, añadir 1,5 mililitros de esta suspensión celular a la placa de cultivo de tejidos tratada con fibronectina e incubar a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos a tres días hasta que el cultivo alcance una confluencia del 50 al 100% y los cultivos de parásitos estén listos para citoaian en el día del ensayo.El cultivo de HBE cinco I debe estar entre 50 y 100 % de confluencia. Mientras tanto, el cultivo de parásitos debe encontrarse en la etapa de trofozoítos pigmentados, con al menos entre 5 y 10 % de parásitos y 2 % de hematocrito. Primero, pipetee 1,5 mililitros de cultivo de parásitos del frasco de cultivo y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar el cultivo a 500 G durante cinco minutos y resuspender en 10 mililitros de medio DMEM incompleto, recién preparado y tibio. Repetir este paso de lavado una segunda vez tras completar la centrifugación final.Resuspenda el precipitado de 30 microlitros en 1,5 mililitros de DMEM incompleto. Medio incompleto suplementado con 1 % de BSA. A continuación, recupere la placa de 60 milímetros de hvac.Five.Las células oculares aspiran el medio de cultivo y lavan dos veces con tres mililitros de DMEM. Medio incompleto. Añada la solución de parásitos, la placa de HPE cinco células oculares e incube en la incubadora de cultivo de tejidos durante 75 minutos en total.Dos veces durante la incubación, suspenda los parásitos agitando suavemente y girando el recipiente tras la incubación. Lave el recipiente cinco veces aspirando el medio mediante una pipeta de plástico tipo espagueti para añadir tres mililitros de medio DMEM incompleto tibio, y luego agite suavemente la placa tras el lavado final; examine el recipiente bajo un microscopio invertido. Si aún se observan muchas células rojas no infectadas, repita el procedimiento de lavado tal como se describió anteriormente para eliminarlas.Después de aspirar el medio del recipiente, resuspenda 40 microlitros de volumen celular empaquetado de glóbulos rojos frescos en medio RPMI completo tibio y agregue la suspensión celular al recipiente. Coloque el recipiente en una cámara de incubación con flujo de aire. Luego, burbujee el recipiente con 3% de dióxido de carbono, 1% de oxígeno y 96% de nitrógeno durante tres minutos.Y coloque la cámara en un incubador a 37 grados Celsius durante la noche. Durante esta incubación, los parásitos en estadio de esquizonte estallan y los merozoítos reinfectan los glóbulos rojos. Al día siguiente, recolecte los parásitos en estadio de anillo mediante lavado.Con medio RPMI incompleto de manera similar a como se hizo anteriormente, pero con una pipetación más enérgica del medio y agitación de la placa. Conservar todo el medio utilizado, que contendrá los glóbulos rojos resuspendidos, en un tubo cónico de 15 mililitros. Examinar la placa bajo un microscopio invertido para asegurarse de que todos los glóbulos rojos han sido eliminados del recipiente antes de la centrifugación.El tubo que contiene el medio de la placa lavada se centrifuga para obtener el sedimento de parásitos; deseche el sobrenadante y resuspenda en cinco mililitros de medio RPMI completo. Coloque la mezcla en un matraz de 25 centímetros cuadrados para el cultivo. Los parásitos se cultivan durante dos a cuatro semanas hasta obtener suficiente material y poder realizar una nueva ronda de selección.Los parásitos HB tres no seleccionados muestran un bajo nivel de unión a las células endoteliales hbe cinco. Esta imagen muestra células hbe cinco fijadas con glutaraldehído al 2% y teñidas con Giemsa, visualizadas bajo el microscopio con un aumento de 1000 veces. Las imágenes se tomaron después de lavar los glóbulos rojos no infectados y los glóbulos rojos infectados no unidos. Después de cada ronda de selección, un número cada vez mayor de parásitos se une a las células endoteliales, y las selecciones pueden repetirse a intervalos de tiempo más cortos tras cinco rondas de selección.Se obtienen poblaciones de parásitos de alta unión como se muestra aquí con los parásitos HB tres HBE. Esta tabla muestra un resumen de las cepas de plasmodium alspar que se seleccionaron con éxito para unirse a HE cinco. Observo que HB tres también se seleccionó en HE cinco activado con TNF tras cinco rondas de selección.La cepa DD dos no mostró un aumento en la unión a HBE cinco I en comparación con la DD dos no seleccionada. Esta imagen con un aumento de 400 veces muestra la unión de parásitos plasmodium alspar HB tres a células endoteliales dérmicas HD MEK antes de la selección. Aquí se muestra la unión de parásitos plasmodium alspar HB tres a la misma línea celular endotelial dérmica después de cuatro rondas de selección.Esta figura muestra la unión de los parásitos de Plasmodium spar HB tres a células endoteliales pulmonares HP ME antes de la selección. Ahora, la unión de los parásitos de Plasmodium spar HB tres a las células HP ME aumenta después de cuatro rondas de selección. Aunque el medio de cultivo para hd e, C y HP EC difiere ligeramente, el protocolo utilizado para la selección fue idéntico al de hbe cinco I. Tras este procedimiento, se pueden realizar métodos como R-T-P-C-R o microanálisis para responder preguntas adicionales, como caracterizar la transcripción del antígeno de superficie variable en parásitos no seleccionados y seleccionados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Función de medición de anticuerpos es la clave para la comprensión de la inmunidad a la malaria Plasmodium falciparum. Este método describe la purificación de merozoitos viables, y la medición de la opsonización dependiente de la fagocitosis mediante citometría de flujo.

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La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

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Plasmodium falciparum Cultivo de gametocitos e infección por mosquitos a través de la alimentación artificial por membrana

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Uso de molienda de haz de iones enfocado para producir láminas vítreas en la rejilla a partir de muestras biológicas congeladas por inmersión para tomografía crioelectrónica.

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

El ensayo estándar de alimentación por membrana (SMFA) se considera el estándar de oro para la evaluación e identificación de posibles compuestos antipalúdicos. Este sistema de alimentación artificial se utiliza para infectar mosquitos para evaluar más a fondo los efectos de tales compuestos sobre la intensidad y prevalencia del parásito Plasmodium falciparum .

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La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

Aprende a seleccionar Plasmodium falciparum para unirse a células endoteliales cerebrales humanas mediante incubación y lavados. Este modelo in vitro facilita el estudio de la sequestración en malaria cerebral y la identificación de dianas terapéuticas.

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

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