Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

El objetivo general de este procedimiento es recolectar ARN total de núcleos cerebrales discretos de una manera repetible, consistente, rentable y libre de ARN. Esto se logra preparando primero un entorno de trabajo libre de enfermeras registradas y extrayendo todo el cerebro de un ratón decapitado. A continuación, se utiliza un picador de tejido operado por micrómetro para cortar secciones de tejido en serie de tamaño uniforme.

A continuación, las regiones cerebrales de interés se microdiseccionan utilizando un núcleo de tejido de diámetro determinado mientras se mantiene el tejido en un entorno de medio libre de ARN. Finalmente, el ARN total se aísla de los núcleos cerebrales extirpados. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren un rendimiento y una calidad de ARN totales suficientes para la preparación de bibliotecas de CDNA posteriores y el perfil del transcriptoma mediante ensayos espectrométricos fotométricos o fluorométricos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la escisión de la región cerebral asistida por microscopía de captura macroscópica o láser, es que se pueden recopilar múltiples regiones cerebrales discretas de interés de un cerebro de ratón individual de una manera repetible y rentable. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como si los distintos perfiles de expresión de transcripción dentro de las regiones cerebrales asociadas sin circuitos neuronales pueden correlacionarse con ciertos rasgos de comportamiento, respuestas ambientales o estado de enfermedad. Para prepararse para la microdisección, complemente 100 mililitros de solución salina equilibrada de Earl's o EBSS con 0,44 gramos de bicarbonato de sodio y 0,884 gramos de glucosa.

Trate el EBSS con 0,1 mililitros de DEPC en un frasco o matraz esterilizable en autoclave con tapa de rosca durante al menos 12 horas. A 37 grados centígrados. Coloque pipetas de vidrio de cinco pulgadas y tres cuartos en un vaso de precipitados de vidrio de un litro y coloque pinceles de artista con las cerdas hacia arriba en un cilindro graduado de vidrio de 100 mililitros.

Agregue suficiente solución de agua tratada con DEPC para cubrir las pipetas y los cepillos. Cubra el vaso de precipitados y el cilindro graduado con papel de aluminio e incube durante al menos 12 horas a 37 grados centígrados después de la incubación de 12 horas con DEPC, caliente, todos los materiales tratados con DEPC a una temperatura superior a 100 grados centígrados durante al menos 15 minutos. Fresco. El EBSS a temperatura ambiente antes de su almacenamiento a cuatro grados centígrados.

Vierta el DD H2O fuera del vaso de precipitados y del cilindro graduado y continúe incubándolos a más de 100 grados centígrados hasta que los materiales estén secos. Sácalos de la incubadora, déjalos enfriar a temperatura ambiente y guárdalos para usarlos más tarde. El día del experimento, trate todas las superficies de trabajo para eliminar el lugar de contaminación de ARN y mantenga el EBSS en un baño de agua establecido a 40 grados centígrados para amortiguar y oxigenar.

El EBSS lo infiltra con un 5% de CO2 y un 95% de oxígeno colocando un tubo de gas en una pipeta de pasto libre de ARN. Y al insertar la pipeta en el EBSS, cubra la abertura del contenedor del EBSS. Configure un cortador de tejido para la sección en serie del tejido cerebral.

Trate las superficies superior e inferior de la cortadora de pañuelos. Para eliminar la contaminación por ARN, coloque una pieza rectangular de papel de filtro watman Número cuatro en la superficie de plexiglás del picador de tejidos. Coloque una hoja de afeitar de doble filo en el brazo picador.

Ponga el micrómetro a cero y ajuste la altura mínima del brazo picador para permitir que la hoja de afeitar corte el papel de filtro, pero no la placa de plexiglás. Reúna todos los materiales adicionales necesarios para la microdisección, incluidas las placas de cultivo celular de 60 por 15 milímetros sin ARN, las puntas de micropipeta sin ARN de 200 microlitros, las tijeras curvas, el hielo seco y los tubos para la recolección de tejidos. Coloque los tubos en hielo seco después de decapitar a un ratón con una guillotina para roedores y extraer todo el cerebro con los nervios posterior y óptico intactos.

Coloque el cerebro en la parte superior de una placa de cultivo de células libres de ARN de 60 por 15 milímetros. A continuación, transfiéralo a la superficie de trabajo de muestreo de tejidos. Utilice una pipeta sin ARN para humedecer de forma conservadora el papel de filtro adherido al picador de tejidos con EBSS.

Humedece el tejido cerebral con EBSS. Transfiera el cerebro al picador de tejidos y colóquelo con la superficie ventral apoyada en el papel de filtro. La línea media perpendicular a la cuchilla del picador y el borde rostral del cerebro colindante con la cuchilla.

Use un pincel de artista tratado con A-D-E-P-C para mantener el cerebro inmóvil aplicando una presión suave a la superficie dorsal del cerebro mientras mantiene el cerebro inmóvil. Levante la palanca del soporte de la cuchilla unos cuatro o cinco centímetros por encima de la superficie del tejido dorsal y manténgala en esta posición. Retire el cepillo de la superficie del cerebro y marque 750 micrómetros.

Usando el micrómetro. Deje que la palanca caiga cortando el tejido y creando una sección coronal de 750 micrómetros mientras la cuchilla picadora permanece inmóvil. Usa un movimiento giratorio con el pincel del artista para deslizar suavemente la sección de tejido lejos de la superficie de la hoja.

Coloque inmediatamente la sección de tejido en el EBSS oxigenado en la placa de Petri. Este corte ya está listo para la microdisección. Repita el procedimiento de corte hasta que se hayan obtenido secciones de cerebro en serie a lo largo de todo el plano codal rost para llevar a cabo la microdisección.

Primero, verifique la iluminación para asegurarse de que la iluminación de la muestra no se obstruya. Ajuste la posición y el flujo de la mezcla de O2 CO2 para mantener un entorno oxigenado amortiguado para el tejido. Durante el procedimiento, identifique la sección coronal del cerebro que incluye la región de interés y, con un pincel de artista, oriéntela plana en la parte inferior de la placa de Petri.

Seleccione el núcleo de tejido con el diámetro adecuado. Sostenga la sección de tejido coronal en su lugar con el pincel de artista y lleve la punta de corte del núcleo de tejido hacia abajo sobre la superficie de la sección de tejido. Mientras aplica presión, presione la punta del núcleo de tejido a través de la sección de tejido y hacia abajo firmemente sobre el fondo de la placa de Petri.

Utilice un movimiento circular rodante para asegurarse de que la región de interés se ha disociado del tejido circundante. Levante con cuidado el núcleo de tejido de la sección de tejido y libere el micropunzón para que flote en el EBSS con un pincel de artista. Deposite inmediatamente el micro punzón de tejido en un tubo de almacenamiento estable mantenido sobre hielo seco a menos 80 grados centígrados.

El tejido debe adherirse fácilmente al costado del tubo. Regrese el tubo contenedor de la muestra de micros al hielo seco. Repita esta microdisección para cada región del cerebro de interés.

Una vez finalizada la microdisección, registre la etiqueta o los códigos de barras respectivos para cada muestra que contenga el tubo. Coloque las muestras de tejido en un congelador a menos 80 grados centígrados hasta la extracción de ARN para extraer el ARN de las muestras de tejido. En primer lugar, prepare un espacio de trabajo libre de ARN.

Prepare una cantidad suficiente de mezcla de perlas magnéticas y solución de unión de lisis como se describe en el manual del kit de aislamiento de ARN total. Retire las muestras de tejido del congelador a menos 80 grados centígrados y coloque los tubos directamente sobre hielo seco. Agregue 100 microlitros de la solución de unión de lisis a un tubo de muestra.

Conecte un mortero de tamaño de tubo de 0,5 mililitros sin nucleasa al mezclador de pellets y homogeneice el tejido con una punta de pipeta sin nucleasa de baja retención. Transfiera la muestra homogeneizada a un pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo utilizando el mismo tipo de punta inmediatamente. Añadir 60 microlitros de isopropanol al 100% a la muestra.

Agregue 20 microlitros de la mezcla de perlas a la muestra y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Siga los pasos del protocolo del kit de aislamiento de ARN total para completar la extracción de ARN total. Finalmente, mida la pureza y la concentración del ARN total resultante ARN total En esta tabla se muestran los datos de micro punzones de varias regiones del cerebro.

Las muestras de ARN aludidas con 30 microlitros de tampón de evolución proporcionaron suficiente ARN total para su uso con productos de preparación de CD NA disponibles comercialmente para aplicaciones de secuenciación de ARN. Además, el rendimiento de ARN y dos proporciones de 60 a dos 80 son valores únicos obtenidos de las muestras de microdisección respectivas para demostrar las lecturas obtenidas de cada región del cerebro y confirman la alta pureza de la muestra Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en ocho a 10 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe minimizar el riesgo de contaminación por ARN de las superficies de trabajo o las muestras de tejido utilizando únicamente materiales libres de ARN o tratados con dsy.